于 平，孫弘宇

(中國石油大慶煉化公司，黑龍江 大慶 163411)

壬二酸分子式為C9H11O4，又稱杜鵑花酸，是一種直鏈飽和二元酸，主要用于制備增塑劑、潤滑劑及特殊塑料和化學(xué)纖維等。目前國內(nèi)外壬二酸的制備方法主要有不飽和脂肪酸的氧化裂解、醇醛等有機(jī)物的氧化反應(yīng)以及生物法等。

利用微生物(如熱帶假絲酵母)發(fā)酵氧化制備壬二酸，原料來源充足(石油煉制的副產(chǎn)物正構(gòu)烷烴)、生產(chǎn)條件溫和(常溫、常壓)、工藝簡單、成本低、污染少、產(chǎn)品純度高。在熱帶假絲酵母轉(zhuǎn)化烷烴生成長鏈二元酸的代謝過程中，烷烴被吸收進(jìn)細(xì)胞后首先經(jīng)α-氧化生成α-一元酸，接著經(jīng)ω-氧化生成目標(biāo)產(chǎn)物α、ω-二元酸。此外，α、ω-氧化過程中生成的一元醇和一元酸都可以被肉毒酰轉(zhuǎn)移酶(CoT酶)轉(zhuǎn)移進(jìn)入微體中經(jīng)過β-氧化而代謝消耗掉。要使生物體內(nèi)積累壬二酸，必須抑制β-氧化，加強(qiáng)菌體的α、ω-氧化。催化菌體的α、ω-氧化的酶均是由細(xì)胞色素P450酶和羥基化酶組成的復(fù)合酶，其中細(xì)胞色素P450酶可以經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生。因而高產(chǎn)壬二酸菌株必須滿足兩個(gè)條件：(1)菌株的α、ω-氧化能力強(qiáng)，在碳水化合物中生長良好、產(chǎn)酸高；(2)菌株的β-氧化能力相對較弱，難以利用烷烴或同化烷烴生長，對壬二酸的降解能力差[1～4]。

近年來，壬二酸生產(chǎn)菌株的選育主要通過物理化學(xué)誘變方法來進(jìn)行，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，新興的離子束生物技術(shù)也被應(yīng)用于長鏈二元酸生產(chǎn)菌株的改造[5～10]。作者在此采用低能離子束注入的方法對壬二酸生產(chǎn)菌種改造進(jìn)行了初步的研究。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌種

熱帶假絲酵母(Candidatropicalis)TSW-1。

1.2 主要培養(yǎng)基

麥芽汁斜面培養(yǎng)基：12 Brix麥芽汁，瓊脂2％。

種子培養(yǎng)基：KH2PO40.8 g，玉米漿0.3 g，酵母膏0.3 g，n-C95 mL，蒸餾水100 mL，pH值5.0。

篩選培養(yǎng)基：

SEL-1培養(yǎng)基：NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO45 g，n-C920 mL，2％瓊脂，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

SEL-2培養(yǎng)基：NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO45 g，葡萄糖3 g，2％瓊脂，蒸餾水100 mL，pH值7.0。

SEL-3培養(yǎng)基：蔗糖3 g，NaH2PO40.2 g，K2HPO40.4 g，酵母膏0.1 g，玉米漿1 g，尿素0.14 g,n-C920 mL，pH值9.0，1％～3％的酚紅指示劑。

發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO40.8 g，NaCl 0.1 g，玉米漿1 g，酵母膏0.2 g，n-C915 mL，蒸餾水100 mL，pH值5.0。

以上培養(yǎng)基均在 121 ℃下滅菌20 min。

1.3 誘變育種及篩選方法

1.3.1 誘變方法

1.3.1.1 樣品制備

將出發(fā)菌株接種于麥芽汁斜面培養(yǎng)基上，30 ℃活化48 h，用5 mL無菌水洗滌菌苔，制成菌懸液。取0.5 mL菌懸液接入裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于30 ℃、110 r·min-1振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長后期。取10 mL培養(yǎng)液于無菌離心管中，3000 r·min-1離心10 min，收集菌體，無菌水洗滌3次，將菌體懸浮于10 mL無菌水中，經(jīng)適當(dāng)稀釋(104)后取5 μL，均勻涂布于2 cm×2 cm的無菌玻片上(以在顯微鏡下觀察不相重疊為宜)，無菌風(fēng)吹干待用。

1.3.1.2 存活率測定

將含菌玻片放入離子束注入儀，抽真空至1×10-4Pa，選擇注入能量和劑量，采用脈沖注入，每個(gè)脈沖注入55 s，以消除大劑量下熱效應(yīng)產(chǎn)生的副作用。離子束注入后取出玻片，置于裝有20 mL蒸餾水的無菌搖瓶中110 r·min-1洗脫菌株，分別取不同種類、能量、劑量的處理液各1 mL適當(dāng)稀釋，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。以注入量為0時(shí)的活菌數(shù)為基準(zhǔn)，計(jì)算不同種類、能量、劑量注入下該菌株的存活率，以注入劑量為橫坐標(biāo)、存活率為縱坐標(biāo)繪制存活率曲線。

1.3.1.3 誘變

按照與存活率測定相同的方法，選擇不同種類、劑量、能量進(jìn)行離子束注入，注入結(jié)束后，取出玻片，置于裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，于28 ℃、110 r·min-1振蕩洗脫菌體。

1.3.2 壬二酸突變株的篩選

將洗脫下的菌體經(jīng)適當(dāng)稀釋后在麥芽汁平板上均勻涂布，28 ℃培養(yǎng)3 d，用無菌牙簽挑取單菌落分別一一對應(yīng)接種于SEL-1培養(yǎng)基和SEL-2培養(yǎng)基上，再培養(yǎng)3 d，選擇在SEL-1培養(yǎng)基上不生長、在SEL-2培養(yǎng)基上生長旺盛的菌株，接種于SEL-3培養(yǎng)基中，測定不同菌株在SEL-3培養(yǎng)基上的R*值(菌落產(chǎn)酸面積/菌落面積)，選擇R*值大的菌株進(jìn)一步進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，測定壬二酸的產(chǎn)率，選擇產(chǎn)率最高者作為生產(chǎn)菌株。

1.4 分析方法

菌體濃度用721型分光光度計(jì)在620 nm波長、1 cm光程的比色皿中測定。

壬二酸的檢測采用酸堿滴定法。

2 結(jié)果與討論

2.1 離子束注入選育壬二酸生產(chǎn)菌株

研究發(fā)現(xiàn)，出發(fā)菌株TSW-1產(chǎn)酸能力較弱，且發(fā)酵周期長。

采用不同種類、不同能量的離子在不同劑量下注入TSW-1進(jìn)行誘變，注入后菌株的存活率曲線如圖1所示。

注入劑量/×1017ions·cm-2

2.2 壬二酸突變菌株的篩選(表1)

表1 離子束注入后突變株的篩選

表2 烷烴利用減弱型或缺陷型菌株產(chǎn)酸能力

從表2可以看出，經(jīng)離子束注入后，許多突變株的壬二酸產(chǎn)率有了大幅的提高，尤其是TSW-b-B7、TSW-b-B8壬二酸產(chǎn)率分別高達(dá)35.75 g·L-1、32.34 g·L-1。對其進(jìn)行積累壬二酸的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表3所示。

從表3可以看出，TSW-b-B7和TSW-b-B8菌株遺傳7代后，其壬二酸產(chǎn)率仍比較穩(wěn)定，在該劑量處選育的突變株其存活率正處于馬鞍型曲線的谷底，這與紫外線、X-射線和乙烯亞胺等多種誘變得到的正向突變較多出現(xiàn)在偏低劑量中一致，但要證明這一點(diǎn)尚需進(jìn)一步研究。TSW-b-B7的壬二酸產(chǎn)率較高且較穩(wěn)定，最高達(dá)35.81 g·L-1，較出發(fā)菌株提高了74.17％，為最佳壬二酸突變菌株，將其編號(hào)為TSW-35，并對其菌落特性進(jìn)行研究。

表3 積累壬二酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)/g·L-1

2.3 離子束注入對菌落形態(tài)的影響

將出發(fā)菌株TSW-1和TSW-35涂平板培養(yǎng)3 d后進(jìn)行觀察，結(jié)果如4所示。

表4 離子束注入對菌落外觀形態(tài)的影響

從表4可以看出，離子束注入對菌落外觀有明顯的誘變影響。因此，可以通過觀察菌落形態(tài)對菌株產(chǎn)酸能力進(jìn)行初步判斷。

3 結(jié)論

采用離子束注入法對壬二酸生產(chǎn)菌株進(jìn)行改造，通過對照培養(yǎng)基和指示劑培養(yǎng)基篩選α、ω-氧化能力增強(qiáng)以及β-氧化能力減弱的突變株，得到一株壬二酸產(chǎn)率達(dá)到35.81 g·L-1的菌株TSW-35，壬二酸產(chǎn)率比出發(fā)菌株提高了74.17％。

離子束注入作為新興的誘變手段，能夠在其它誘變方法無能為力的情況下誘發(fā)突變產(chǎn)生，其存活率曲線為典型的“馬鞍型”，能夠在低致死(存活率20％～30％)的情況下誘發(fā)大量正突變菌株。

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