高 茜,管 瑩,曾婉俐,朱洲海,李雪梅,繆明明,夭建華

(云南煙草科學(xué)研究院,云南 昆明 650106)

中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細(xì)胞由于生長快、易培養(yǎng)，被廣泛應(yīng)用于生物工程和化學(xué)物質(zhì)的毒理學(xué)評價(jià)。全球至少70％的藥物蛋白來源于CHO細(xì)胞系，用CHO細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品每年超過300萬美元[1]。國內(nèi)外很多組織與機(jī)構(gòu)都采用CHO細(xì)胞系來評價(jià)化學(xué)品或食品添加劑的毒性：OECD化學(xué)物質(zhì)試驗(yàn)指南中推薦采用CHO細(xì)胞作為哺乳動(dòng)物基因突變檢測的細(xì)胞系[2]，F(xiàn)AO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(JECFA)使用CHO細(xì)胞系來評價(jià)食品添加劑的安全性[3]，加拿大衛(wèi)生部和雷諾公司采用CHO細(xì)胞系用來評價(jià)卷煙煙氣的細(xì)胞毒性[4]。

細(xì)胞長期的連續(xù)傳代培養(yǎng)會對其結(jié)構(gòu)與功能特性造成影響，最終導(dǎo)致基因工程蛋白產(chǎn)量的降低以及檢測結(jié)果的不穩(wěn)定。有報(bào)道指出，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長將增加培養(yǎng)體系中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的環(huán)境壓力，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[5]。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡；而細(xì)胞壞死是細(xì)胞受到強(qiáng)烈理化或生物因素作用引起細(xì)胞無序變化的死亡。作為一個(gè)程序性細(xì)胞死亡的模式，細(xì)胞凋亡是一個(gè)對于外部信號或者內(nèi)部壓力的有效的控制和監(jiān)管機(jī)制。雖然對于動(dòng)物細(xì)胞在生物反應(yīng)器中大規(guī)模培養(yǎng)的細(xì)胞凋亡有所報(bào)道[6]，但是對于其體外連續(xù)傳代培養(yǎng)的凋亡狀況卻少有研究。因此，作者在此對CHO細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)傳代培養(yǎng)，并對其凋亡情況進(jìn)行了研究，以期為CHO細(xì)胞的蛋白生產(chǎn)及化學(xué)品的毒理學(xué)評價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 細(xì)胞、試劑與儀器

中國倉鼠卵巢細(xì)胞，中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫；DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液、PBS、胎牛血清，美國Giboco公司；胰蛋白酶，美國Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，南京凱基公司；JC-1和細(xì)胞凋亡陽性對照試劑盒，碧云天公司；Caspase-3底物Ac-DEVD-pNA、Caspase-8底物Ac-IETD-pNA，美國Sigma公司。

流式細(xì)胞儀(FACSVantage SE)、流式管，BD Biosciences公司；熒光顯微鏡(90i)、TS100-F-HMC型倒置顯微鏡，Nikon公司；CO2培養(yǎng)箱，Thermo公司；二級生物安全柜，Heal Force公司；6孔板、96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶，美國Corning公司；XS204型分析天平，Mettler Toledo公司；DT5-5型離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；全波段便攜式分光光度計(jì)，GE公司。

1.2 方法

1.2.1 CHO細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)

在37 ℃水浴中復(fù)蘇CHO細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。調(diào)整細(xì)胞密度，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含10％胎牛血清)在5％ CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，此時(shí)記為第1代細(xì)胞。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80％后按1∶4的比例傳代，傳代后記為第3代，連續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞生長停滯為止，共傳到17代。

1.2.2 細(xì)胞樣品處理

每隔4代取CHO細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞并接種于6孔板，每孔約5×105個(gè)細(xì)胞。正常培養(yǎng)24 h后將細(xì)胞分為兩組，一組不做處理，另一組加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)試劑Apopida(1/3000倍稀釋)，兩組都繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌后用胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染檢測、線粒體膜電位去極化檢測、Caspase-3及Caspase-8的酶活性測定。

1.2.3 Annexin V-FITC/PI雙染檢測

細(xì)胞凋亡與壞死用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測[7]。將收集的細(xì)胞重懸于Annexin V-FITC/PI雙染檢測試劑盒中的Binding buffer中，細(xì)胞濃度約為5×105個(gè)·mL-1。取500 μL的細(xì)胞懸液，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后，再加入5 μL Propidiumiodide(PI)，混勻。室溫避光反應(yīng)10 min后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用至少10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.4 線粒體膜電位的檢測

線粒體膜電位用JC-1染色法檢測[8]。將收集的細(xì)胞重懸于PBS中，細(xì)胞濃度約為5×105個(gè)·mL-1。加入JC-1，終濃度為2 μg·mL-1。樣品在黑暗中于37 ℃孵育20 min，然后用流式細(xì)胞儀分析。細(xì)胞用前向散射(FSC)和側(cè)散射(SSC)的門控來分析。每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析使用至少10 000個(gè)細(xì)胞。

1.2.5 Caspase-3及Caspase-8的酶活性測定

Caspase-3及Caspase-8的酶活性用產(chǎn)生的四肽p-硝基苯胺(pNA)底物來做比色測定[9]。處理后的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解。然后將含有30 μg蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解物與50 μmol·L-1Ac-DEVD-pNA(Caspase-3底物)或50 μmol·L-1Ac-IETD-pNA(Caspase-8底物)孵育。反應(yīng)體積為100 μL，反應(yīng)緩沖溶液如下：50 mmol·L-1Hepes，pH值7.5，10 mmol·L-1DTT，1 mmol·L-1EDTA，1％ 蔗糖，0.1％ Chaps。反應(yīng)物置于96孔板，37 ℃下孵育?？偡磻?yīng)時(shí)間持續(xù)4 h，其中每隔30 min取出一組在405 nm波長處測定吸光度。對底物裂解速度(pmol硝基苯胺·min-1·μg-1總蛋白)用標(biāo)準(zhǔn)硝基苯胺來校準(zhǔn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 連續(xù)傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞凋亡和壞死的檢測結(jié)果

圖1為不同代次CHO細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)劑Apopida誘導(dǎo)下的凋亡與壞死散點(diǎn)圖。

圖1 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)劑存在下的凋亡與壞死象限圖

Annexin V與磷脂酰絲氨酸(PS)有高度親和力，在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。對凋亡晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，AV+/PI-象限為早期凋亡細(xì)胞，AV+/PI+象限為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞。由圖1可知，在相同濃度的凋亡誘導(dǎo)劑作用下，細(xì)胞在前9代被誘導(dǎo)發(fā)生的凋亡率(AV+/PI-象限)比較穩(wěn)定，而在第13代及第17代時(shí)，細(xì)胞被誘導(dǎo)的凋亡率顯著上升，柱形統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖2。

圖2 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞凋亡柱形統(tǒng)計(jì)圖

由圖2可知，在連續(xù)傳代9代之前，細(xì)胞的自然凋亡率均較低(<2％)，且沒有顯著變化，在第13代時(shí)，細(xì)胞的自然凋亡率顯著上升(3倍于第1代細(xì)胞)。

由圖1可知，第9代之前的細(xì)胞的壞死率沒有明顯改變，但在第13代及第17代時(shí)，細(xì)胞的壞死率上升，柱形統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖3。

由圖3可知，與細(xì)胞凋亡情況相近，在連續(xù)傳代9代之前細(xì)胞的自然壞死率非常低(<1％)。但與凋亡狀況不同的是，細(xì)胞在第13代及第17代時(shí)仍沒有明顯的自然壞死。

由此可見，隨著連續(xù)傳代次數(shù)的增加，CHO細(xì)胞的生長狀態(tài)發(fā)生了改變，在第9代以后，細(xì)胞狀態(tài)逐漸變得不穩(wěn)定，對凋亡誘導(dǎo)劑的反應(yīng)也更為敏感，而在第13代以后，細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生壞死現(xiàn)象。

圖3 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞壞死柱形統(tǒng)計(jì)圖

2.2 連續(xù)傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞線粒體膜電位檢測結(jié)果

圖4為連續(xù)傳代的CHO細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)劑Apopida存在下的線粒體膜電位的散點(diǎn)圖。

圖4 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞在凋亡誘導(dǎo)劑存在下的線粒體膜電位散點(diǎn)圖

用親脂陽離子JC-1作為檢測線粒體膜電位的探針。在非凋亡細(xì)胞中，JC-1在胞漿以綠色單體形式存在，在線粒體以紅色聚集體形式存在。而在凋亡細(xì)胞中，線粒體膜電位消失，JC-1僅以單體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，因此通過檢測紅色熒光和綠色熒光的比例來觀察線粒體膜電位的變化。由圖4可知，在相同濃度的凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，第13代及第17代細(xì)胞表現(xiàn)得更為敏感，線粒體膜電位下降的細(xì)胞比率比第1代細(xì)胞顯著上升，柱形統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖5。

圖5 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞線粒體膜電位柱形統(tǒng)計(jì)圖

由圖5可知，在連續(xù)傳代第9代后，細(xì)胞線粒體膜電位有所下降，尤其在凋亡誘導(dǎo)劑存在的情況下，細(xì)胞線粒體膜電位下降明顯。

2.3 連續(xù)傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞Caspase-3活性比較(圖6)

Caspase-3作為一個(gè)效應(yīng)Caspase，在凋亡過程中起著重要的作用[10]。為了進(jìn)一步檢測CHO細(xì)胞在連續(xù)傳代過程中是否引起細(xì)胞凋亡，用切割底物Ac-DEVD-pNA來檢測Caspase-3是否被激活。由圖6可知，在無凋亡誘導(dǎo)劑存在的情況下，Caspase-3的活性在前9代未發(fā)生明顯變化，第13代時(shí)略有上升。而在凋亡誘導(dǎo)劑存在的情況下，第13代及第17代細(xì)胞的Caspase-3酶活性都高于第9代之前的細(xì)胞。

圖6 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞Caspase-3活性檢測圖

2.4 連續(xù)傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞Caspase-8活性比較(圖7)

圖7 連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞Caspase-8活性檢測圖

Caspase-8的活化是外源性細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵步驟[11]，采用Ac-IETD-pNA檢測連續(xù)傳代CHO細(xì)胞是否有Caspase-8的激活。由圖7可知，在沒有凋亡誘導(dǎo)劑存在時(shí)，Caspase-8的酶活性在第1代到第17代細(xì)胞中均沒有明顯的變化。而在凋亡誘導(dǎo)劑存在的情況下，其酶活性在第1代到第17代細(xì)胞中并未產(chǎn)生明顯的改變，表明Caspase-8未被激活。

2.5 討論

CHO細(xì)胞雖屬于無限細(xì)胞系，但長期的連續(xù)培養(yǎng)仍可能對其結(jié)構(gòu)與功能造成不良影響[12]。

蛋白激酶RIP3是啟動(dòng)細(xì)胞凋亡和程序性壞死的重要分子開關(guān)，可以將腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)換為細(xì)胞壞死[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室所使用CHO細(xì)胞在連續(xù)傳代第9代之前的狀態(tài)較為穩(wěn)定，細(xì)胞自然凋亡率很低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長和傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞自然凋亡率逐漸升高，說明細(xì)胞的生長狀態(tài)發(fā)生了改變。同時(shí)，細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑的反應(yīng)也更為敏感，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的比例上升，而隨著傳代培養(yǎng)的繼續(xù)，細(xì)胞對凋亡誘導(dǎo)劑出現(xiàn)了壞死反應(yīng)，說明細(xì)胞的狀態(tài)進(jìn)一步惡化，這與國際上對于細(xì)胞凋亡和壞死的轉(zhuǎn)變的研究是一致的。

線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡另一個(gè)重要特征之一，Bax、Bak、Bcl-2和Bcl-XL通過控制線粒體膜的通透性從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[14]。JC-1染色法表明CHO細(xì)胞線粒體膜電位在連續(xù)傳代9代之后有所下降，尤其是在凋亡誘導(dǎo)劑存在的情況下，線粒體膜電位的下降更為明顯。線粒體膜電位的消失將導(dǎo)致細(xì)胞色素c從線粒體中釋放并與凋亡相關(guān)因子1(Apaf-1)結(jié)合，形成多聚體，并促使Caspase-9與其結(jié)合形成凋亡小體，Caspase-9被激活，進(jìn)而激活其它的Caspase如Caspase-3等，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡的途徑主要有兩條，一條是通過上述的線粒體釋放細(xì)胞色素c從而激活Caspase(內(nèi)源性凋亡途徑)，另一條是通過胞外信號激活細(xì)胞內(nèi)的Caspase(外源性凋亡途徑)。這些活化的Caspase可將細(xì)胞內(nèi)的重要蛋白降解，引起細(xì)胞凋亡。在外源性細(xì)胞凋亡途徑中，Caspase-8的前體被死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Death effector domains)募集到死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物上，然后通過自剪切激活自身。下游的效應(yīng)Caspases比如Caspases-1、Caspases-3、Caspases-6、Caspases-7被激活的Caspase-8切割并激活[15]。本研究證明了第5代后的CHO細(xì)胞的Caspase-3被激活，而Caspase-8并未被激活，這說明外部凋亡途徑可能未參與凋亡。而線粒體膜電位的下降也表明連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞凋亡可能主要是通過內(nèi)部凋亡途徑。

有研究報(bào)道連續(xù)傳代培養(yǎng)STO細(xì)胞(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)會發(fā)生退行性變化，但是定期解凍STO細(xì)胞復(fù)蘇使用，可恢復(fù)其生長狀況[16]。因此，雖然連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞會發(fā)生凋亡，但其經(jīng)過凍存后是否有所恢復(fù)還有待進(jìn)一步研究。另外，由于本研究的CHO細(xì)胞購自于昆明細(xì)胞庫，沒有詳細(xì)的凍存次數(shù)及細(xì)胞代次等資料，因此其它來源的CHO細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行凋亡指標(biāo)等檢測，從而控制其細(xì)胞狀態(tài)，以利于生產(chǎn)和研究。

3 結(jié)論

采用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測磷脂酰絲氨酸外翻、JC-1染色法檢測線粒體膜電位、底物切割法檢測Caspase-3及Caspase-8酶活性等4個(gè)指標(biāo)來評估CHO細(xì)胞凋亡。CHO細(xì)胞經(jīng)歷長期連續(xù)傳代培養(yǎng)后，會發(fā)生內(nèi)部凋亡途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)對凋亡誘導(dǎo)劑的敏感性顯著增加。因此建議在生物工程生產(chǎn)和化學(xué)品毒理學(xué)評價(jià)檢測時(shí)，可采用凋亡指標(biāo)來檢測細(xì)胞狀態(tài)，從而提高基因工程菌蛋白的生產(chǎn)效率及化學(xué)品毒理學(xué)評價(jià)的準(zhǔn)確性。

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