盧雪梅，黃演婷，金小寶，汪 潔，朱家勇

(1.廣東藥學(xué)院 藥用生物活性物質(zhì)研究所,廣東 廣州 510006;2.廣東省生物活性藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510006)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV) 主要在肝細(xì)胞內(nèi)寄生和復(fù)制，導(dǎo)致急慢性乙型肝炎的發(fā)生，甚至引起肝硬化和肝癌[1]，目前臨床上用于抗HBV的藥物無(wú)組織和器官選擇性，療效不夠理想。作者在前期研究中將肝靶向穿膜肽(Hepatocyte-targeting and penetrating peptide，HTPP)與家蠅抗菌肽天蠶素(Muscadomesticacecropin，MDC)融合，構(gòu)建的肝靶向穿膜融合多肽 HTPP-MDC有望成為定位準(zhǔn)確、高效結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)性阻斷和靶向殺傷的新型抗HBV藥物，對(duì)降低乙型肝炎病毒感染引起的肝臟疾病的發(fā)病率和死亡率具有深遠(yuǎn)的意義。

但如何低成本、大量獲得多肽類(lèi)藥物以滿(mǎn)足其開(kāi)發(fā)與應(yīng)用的需求是科研工作者積極探索的課題。目前，多肽類(lèi)藥物的來(lái)源主要有以下幾種：(1)直接從生物體分離純化，由于數(shù)量太少且成本太高，作為應(yīng)用開(kāi)發(fā)幾乎是不可能。(2)根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進(jìn)行人工合成，也存在成本高、活性低等一系列問(wèn)題[2]。(3)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)，該領(lǐng)域的飛速發(fā)展為低成本多肽類(lèi)藥物生產(chǎn)提供了一種可持續(xù)方案。通過(guò)基因重組技術(shù)，可大量高效地生產(chǎn)多種生物活性多肽如干擾素、生長(zhǎng)因子等，在腫瘤、乙肝、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、創(chuàng)傷以及艾滋病等治療領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[3]。

作者在此利用基因重組技術(shù)將目的基因亞克隆入原核表達(dá)載體pET32a(+)中，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)，采用 SDS-PAGE 和 Western blot 對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)與鑒定，擬為HTPP-MDC的生物學(xué)活性研究及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

宿主菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)，質(zhì)粒HTPP-MDC/pMD20-T，自行保存；質(zhì)粒pET32a(+)，Novagen公司；限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ、HindⅢ、T4DNA 連接酶、Taq DNA 聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，TaKaRa公司；TIANgel Midi Purification Kit、TIANpure Midi Plasmid Kit，北京TIANGEN公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，F(xiàn)ermentas公司；丙烯酰胺、N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、SDS，Sigma公司；TEMED，北京鼎國(guó)生物公司；6×His Tag小鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體，美國(guó)Pharmacia公司；DAB顯色試劑盒，武漢博士德公司；其它化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒HTPP-MDC/pMD20-T為模板，用上游引物P1:5′-CGGGGTACCGACGACGACGACAAGAA-TAGTCGTTCACTTG-3′和下游引物P2:5′-CCC-AAGCTTATTAGTTACCCTTTAATGTGGCGGC-A3′(下劃線為酶切位點(diǎn)，粗斜體為腸激酶酶切位點(diǎn)) PCR擴(kuò)增出目的基因。將獲得的PCR片段和表達(dá)載體pET32a(+)分別用限制性?xún)?nèi)切酶KpnⅠ 和HindⅢ進(jìn)行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物后，用T4DNA連接酶連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，轉(zhuǎn)化菌種涂于含有氨芐青霉素的平板，培養(yǎng)16～18 h后，挑取單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液PCR、酶切鑒定及DNA測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物鑒定

將純化的HTPP-MDC/pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選，挑取陽(yáng)性單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基(1％的蛋白胨，0.5％的酵母抽提粉，85 mmol·L-1的氯化鈉)中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)8～12 h，然后將此菌液按1∶100比例接種到新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至OD600=0.6時(shí)，加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)4～6 h，離心收集菌體，進(jìn)行15％ SDS-PAGE電泳。

將收集的菌體重懸于0.1 BV預(yù)冷的細(xì)菌裂解液(0.2 mol·L-1NaCl，1 mmol·L-1EDTA，25 mmol·L-1Tris-HCl，pH值8.0)中，在超聲波破碎儀下破碎12 min(功率250 W，開(kāi)6 s，停6 s)，然后于4 ℃、14 000 r·min-1下離心30 min，分別取上清和沉淀進(jìn)行15％ SDS-PAGE，分析表達(dá)產(chǎn)物的可溶性。

IPTG誘導(dǎo)后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)15％的SDS-PAGE電泳后通過(guò)半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(Polyvinylidene difluoride，PVDF)上，以6×His Tag小鼠單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體為二抗，用DAB顯色系統(tǒng)顯色，檢測(cè)分析Western blot結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

用PCR方法從HTPP-MDC/pMD20-T質(zhì)粒中擴(kuò)增目的基因HTPP-MDC，片段長(zhǎng)度為220 bp，凝膠電脈檢測(cè)其大小與預(yù)期一致(圖1)。經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切后產(chǎn)生含有目的基因的DNA片段，定向插入經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ雙酶切的含有6×His的pET32a(+)表達(dá)載體中，從而構(gòu)建重組質(zhì)粒HTPP-MDC/pET32a(圖2)。在含有氨芐青霉素的平板上挑取重組質(zhì)粒HTPP-MDC/pET32a轉(zhuǎn)化后的E.coliBL21單菌落培養(yǎng)并進(jìn)行菌液PCR，初步鑒定為陽(yáng)性的克隆搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行KpnⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒經(jīng)KpnⅠ/HindⅢ雙酶切出與預(yù)期大小一致的條帶(圖3)，驗(yàn)證的質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序分析，無(wú)堿基錯(cuò)配，最終確定重組表達(dá)質(zhì)粒HTPP-MDC/pET32a構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker 1.HTPP-MDC PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 HTPP-MDC/pET32a重組質(zhì)粒圖譜

M1/M2.DL2000/DL10 000 DNA Marker 1.重組質(zhì)粒的PCR鑒定 2.經(jīng)Kpn Ⅰ、Hin dⅢ雙酶切的重組質(zhì)粒

2.2 融合基因的誘導(dǎo)表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)4～6 h后取樣，經(jīng)15％ SDS-PAGE電泳檢測(cè)在大小約25 kDa處出現(xiàn)蛋白條帶，而未誘導(dǎo)的菌體蛋白未出現(xiàn)相應(yīng)的條帶(圖4)。這是因?yàn)?，載體pET32a(+)具有Trx標(biāo)簽，蛋白分子量約為18 kDa，而HTPP-MDC分子量約為7 kDa，因此表達(dá)的蛋白分子量約25 kDa。超聲破碎后離心取上清和沉淀進(jìn)行15％ SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示：表達(dá)蛋白主要存在上清中，為可溶性表達(dá)(圖4)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 1，2.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后 3，4.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導(dǎo)后裂解液上清和沉淀

由于融合蛋白含有pET32a(+)編碼的6×His標(biāo)簽，采用鼠源His單克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot，結(jié)果顯示誘導(dǎo)后的含重組質(zhì)粒表達(dá)菌株在25 kDa處有一條特異性條帶而未誘導(dǎo)的沒(méi)有，進(jìn)一步證實(shí)了表達(dá)的蛋白為帶有His標(biāo)簽的融合蛋白(圖5)。

M.蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn) 1，2.E.coli BL21/pET32a-HTPP-MDC誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后全菌蛋白

2.3 討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)周期短、成本低廉、目的基因表達(dá)水平高等特點(diǎn)，是生物技術(shù)研究和生物藥物產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程中的重要工具。但如果表達(dá)的生物活性多肽本身具有抗菌活性，則對(duì)表達(dá)宿主菌具有殺傷作用，即所謂工程菌表達(dá)“毒性”蛋白時(shí)出現(xiàn)“自殺”現(xiàn)象，其直接表達(dá)較困難。另外，利用基因工程技術(shù)表達(dá)小分子多肽時(shí)，產(chǎn)物容易降解，得率較低。因此，表達(dá)這類(lèi)多肽時(shí)采用融合表達(dá)方式較為理想。應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后，通過(guò)工具酶切除融合標(biāo)簽，可得到具有天然活性的重組多肽[4]。

本研究采用的原核表達(dá)載體為pET32a(+)，它是一種帶有T7噬菌體Lac強(qiáng)啟動(dòng)子的原核高效融合表達(dá)載體，載體中的硫氧還原蛋白標(biāo)簽(Trx Tag)和外源基因一同表達(dá)，不僅能增強(qiáng)融合表達(dá)蛋白的溶解性，而且在保護(hù)融合蛋白免受蛋白酶降解時(shí)也起到一定作用[5]。但標(biāo)簽蛋白會(huì)在一定程度上影響目的蛋白的生物學(xué)活性，所以在很多時(shí)候需要將標(biāo)簽蛋白切除[6]。常用酶切割的方法切除標(biāo)簽蛋白[7，8]，其中腸激酶最為常用。pET32a(+)載體中本身帶有一個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)，但如果利用其本身的這個(gè)腸激酶酶切位點(diǎn)，由于限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的存在，酶切后的目的蛋白會(huì)在N端引入不必要的氨基酸殘基，有可能對(duì)目的蛋白的功能產(chǎn)生一定的影響。因此，本研究在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒時(shí)，在目的基因前加入了編碼腸激酶酶切位點(diǎn)的核苷酸序列，表達(dá)出來(lái)的融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后產(chǎn)生目的蛋白的天然N末端，從而保證了目的蛋白的完整性和真實(shí)性。

3 結(jié)論

通過(guò)雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化等方法成功構(gòu)建了融合表達(dá)質(zhì)粒HTPP-MDC/pET32a，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE分析表明重組融合蛋白為可溶性表達(dá)，Western blot雜交證實(shí)了表達(dá)蛋白的抗原活性。為HTPP-MDC后續(xù)的生物學(xué)活性研究及產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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