張鳳梅，楊 柳，孟昭宇，吳億勤，伊奧爾，牟定榮

(紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 玉溪 653100)

煙草特有亞硝胺(TSNAs)是煙草中N-亞硝胺含量最豐富的一類(lèi)亞硝胺物質(zhì)，只存在于煙草、煙草制品和卷煙煙氣中。目前研究較為深入的TSNAs包括N-亞硝基去甲基煙堿(NNN)、N-亞硝基假木賊堿(NAB)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和4-(N-甲基-N-亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-丁酮(NNK)。由于對(duì)健康的關(guān)注，出現(xiàn)了一系列TSNAs的檢測(cè)方法，主要集中在GC-TEA法[1]和LC-MS/MS法[2～4]。然而，GC-TEA法前處理純化步驟多、分析周期長(zhǎng)、溶劑耗量大、檢測(cè)器專(zhuān)屬性強(qiáng)、樣品通量低、環(huán)境污染嚴(yán)重，LC-MS/MS法又需要SPE純化的前處理步驟或不能很好地消除基質(zhì)的干擾。為此，作者在前人工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了LC-MS/MS前處理方法，建立了一種快速、準(zhǔn)確的TSNAs測(cè)定方法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

超純水，甲醇、乙酸銨、乙酸為色譜純。

標(biāo)準(zhǔn)品：NAB、NAT、NNK、NNN、NAB-d4、NAT-d4、NNK-d4和NNN-d4，純度≥98%，加拿大TRC公司。

API3200QTRAP型質(zhì)譜儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；Waters Acquity型超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Cerulean SM450型直線(xiàn)式吸煙機(jī)，Cerulean Ltd.；Milli-Q50型超純水儀，美國(guó)Millipore公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；CP2245型電子天平(感量0.1 mg)，德國(guó)Sartorius公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流速0.4 mL·min-1；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：0.2%的乙酸溶液；梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

表1 高效液相色譜梯度洗脫條件

1.3 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源(ESI)；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM；電噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：650 ℃；輔助氣Gas1壓力：0.345 MPa；輔助氣Gas2壓力：0.483 MPa；各分析物的定量離子對(duì)、定性離子對(duì)及碰撞能量(CE)見(jiàn)表2。

1.4 工作溶液

按濃度梯度為1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1配制NNN、NAB、NAT和NNK的標(biāo)準(zhǔn)溶液(甲醇為溶劑，內(nèi)標(biāo)NNN-d4、NAB-d4、NAT-d4和NNK-d4的濃度為10 ng·mL-1)。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的內(nèi)標(biāo)濃度與樣品的內(nèi)標(biāo)濃度相同。

表2 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)表

1.5 樣品制備

將捕集了卷煙煙氣的劍橋?yàn)V片放入50 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入10 mL含10 ng·mL-1內(nèi)標(biāo)的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液超聲萃取30 min后，靜置5 min。取1 mL萃取液過(guò)0.22 μm的濾膜到色譜瓶中待分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 內(nèi)標(biāo)的選擇

選擇同位素內(nèi)標(biāo)法定量，分別考察了1種和4種內(nèi)標(biāo)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。結(jié)果表明，選擇1種內(nèi)標(biāo)NNK-d4定量NAB時(shí)，由于離子抑制作用和基質(zhì)效應(yīng)的存在，測(cè)量結(jié)果明顯偏高，此結(jié)果與文獻(xiàn)[4]的報(bào)道一致。為準(zhǔn)確定量考慮，選擇4種內(nèi)標(biāo)。

2.2 萃取方式的選擇

對(duì)樣品分別進(jìn)行超聲萃取30 min和振蕩萃取30 min。結(jié)果表明，超聲萃取30 min的萃取效率高于振蕩萃取。故選擇超聲萃取的方式。

2.3 萃取時(shí)間的選擇

對(duì)同一樣品分別超聲萃取10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、50 min。結(jié)果表明，超聲萃取30 min以后，NAB、NAT、NNK、NNN的萃取效率均達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，為節(jié)約時(shí)間并避免引入更多的干擾成分，選擇萃取時(shí)間為30 min。

2.4 精密度

對(duì)同一樣品進(jìn)行5次日內(nèi)和日間平行性測(cè)定。結(jié)果表明，4種TSNAs日內(nèi)、日間測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在1.30%～4.53%和1.25%～5.41%之間，說(shuō)明方法的重復(fù)性較好。

2.5 工作曲線(xiàn)

取系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別進(jìn)樣，得到4種TSNAs的工作曲線(xiàn)，線(xiàn)性良好。取最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)10次進(jìn)樣，計(jì)算測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，分別用3倍和10倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差表示檢出限和定量限。4種TSNAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見(jiàn)表3。

表3 4種TSNAs的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 回收率

對(duì)同一樣品采用樣品加標(biāo)，在高、中、低三個(gè)含量水平進(jìn)行了回收率的測(cè)定，平均回收率均在90%以上，表明本方法的回收率較高。

2.7 樣品測(cè)定

對(duì)5種市售卷煙樣品主流煙氣中TSNAs進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種市售卷煙樣品主流煙氣中TSNAs含量測(cè)定結(jié)果/ng·cig-1

3 結(jié)論

建立了一種高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺的方法。采用含內(nèi)標(biāo)的0.1 mol·L-1乙酸銨溶液直接對(duì)收集了主流煙氣的劍橋?yàn)V片進(jìn)行超聲萃取30 min，過(guò)膜后的萃取液用帶電噴霧裝置的LC-MS/MS儀進(jìn)行分析。該方法數(shù)據(jù)可靠、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好。

參考文獻(xiàn)：

[1] 謝復(fù)煒，金永明，趙明月，等.國(guó)內(nèi)外主要品牌卷煙主流煙氣中煙草特有N-亞硝胺的對(duì)比分析[J].中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2004，10(5)：8-15.

[2] 朱文靜，楊俊，劉百戰(zhàn)，等.HPLC-MS/MS對(duì)卷煙煙氣中4種煙草特有亞硝胺的快速測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，(1)：26-30.

[3] Xiong Wei，Hou Hongwei，Jiang Xingyi，et al.Simultaneous determination of four tobacco-specificN-nitrosamines in mainstream smoke for Chinese Virginia cigarettes by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and validation under ISO and "Canadian intense" machine smoking regimes[J].Analytica Chimica Acta，2011，674(1)：71-78.

[4] Wagner K A，F(xiàn)inkel N H，F(xiàn)ossett J E，et al.Development of a quantitative method for the analysis of tobacco-specific nitrosamines in mainstream cigarette smoke using isotope dilution liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Anal Chem,2005,77(4):1001-1006.