魯 莽

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院材料科學(xué)與工程學(xué)院，江西 景德鎮(zhèn) 333403)

植物根系能向根際釋放多種有用的小分子化合物。陸生植物所能經(jīng)歷的一些復(fù)雜的物理、化學(xué)和生物的相互作用，通常出現(xiàn)在根系與其周圍的土壤環(huán)境即根際間，如根-根、根-昆蟲以及根-微生物之間。過(guò)去數(shù)十年來(lái)，學(xué)術(shù)界在不懈地努力探索這些不同類型的相互作用[1]，其中根系分泌物在調(diào)節(jié)這些生物相互作用中的重要性已被認(rèn)可[2～4]。根際代表一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的相互作用的前線，位于根系與致病或有益土壤微生物、無(wú)脊椎動(dòng)物及競(jìng)爭(zhēng)性根系之間[1]。然而，因?yàn)橹参锔瞪畈卦诘叵?，其中的許多現(xiàn)象難為人知，尤其是一些化學(xué)信息在調(diào)節(jié)地下生物相互作用中的角色才剛被認(rèn)識(shí)。植物根系與其它土壤微生物和鄰近植物根系間的化學(xué)信息傳遞通常基于根誘導(dǎo)的化學(xué)物質(zhì)。同一化學(xué)信息可對(duì)不同的受體誘導(dǎo)出相異的響應(yīng)。根系分泌物的化學(xué)成分可阻止某一生物體而吸引另一生物體，也可能吸引兩種對(duì)植物有不同作用的差異很大的生物體。

根系分泌物的產(chǎn)生量隨植物的種類、栽培品種、株齡及脅迫因素而異。大量的有機(jī)化合物釋放在幼根表面[5]，這些物質(zhì)有高分子量的多聚糖和多種低分子量的有機(jī)物，如簡(jiǎn)單的多糖(樹(shù)膠醛糖、麥芽糖、果糖、葡萄糖、甘露糖、寡糖)、氨基酸(精氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、天冬酰胺酸、谷氨酸)、有機(jī)酸(乙酸、安息香酸、蘋果酸、阿魏酸)和酚類物質(zhì)等。此外，根系也以較大的量釋放一些大分子物質(zhì)諸如類黃酮、酶、脂肪酸、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、核苷酸、丹寧酸、類固醇、類萜、生物堿、多炔、維生素等。這些化合物中的多種涉及到初級(jí)或次級(jí)的植物代謝過(guò)程和植物抗性[6]。作者在此收集人工培養(yǎng)得到的植物(黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿)根系及其分泌物，并探討其對(duì)微生物生長(zhǎng)及活性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料和試劑

輕質(zhì)原油(飽和烴65.14%，芳烴24.37%，膠質(zhì)9.02%，瀝青質(zhì)1.47%)，大港油田。

高羊茅、黑麥草和紫花苜蓿為試驗(yàn)用植物，種子購(gòu)自北京百綠公司。

二氯甲烷及其它試劑均為分析純。

1.2 菌株和培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)室篩選保存的原油降解優(yōu)良菌株W，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌。

Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eCl30.05 g，CaCl2·H2O 0.02 g，蒸餾水1 L，pH值7.0，121 ℃蒸汽滅菌15 min。

1.3 植物根系及其分泌物的制備

植物種子經(jīng)3% H2O2浸泡30 min后，用去離子水沖洗3次。將滅菌后的種子播撒于覆蓋在燒杯口的紗布上，燒杯中盛滿半強(qiáng)度Hoagland′s營(yíng)養(yǎng)液，液面稍稍沒(méi)過(guò)紗布。播種后燒杯放于人工氣候箱中，培養(yǎng)條件：白天16 h，溫度24 ℃，光照強(qiáng)度6000 lx，濕度80%；夜晚8 h，溫度20 ℃，濕度80%。植物每隔1 d用無(wú)菌水補(bǔ)充液位，并每7 d補(bǔ)充1次半強(qiáng)度Hoagland′s營(yíng)養(yǎng)液。植物培養(yǎng)28 d后，進(jìn)行收獲。剪去葉片，塑料袋包裝密封，4 ℃保存。使用前將根剪成約1 cm長(zhǎng)小段。根系分泌物溶液以0.2 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃保存。

1.4 根系及其分泌物對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響

以保存?zhèn)溆玫母导捌浞置谖餅榛|(zhì)，考察其對(duì)菌株W生長(zhǎng)狀況的影響，實(shí)驗(yàn)分2個(gè)處理:(a)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.1 g碎根；(b)菌株W+35 mL Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5 mL根系分泌物。

將菌株W活化2 d，8000 r·min-1離心收集菌細(xì)胞，無(wú)菌水洗滌3次后重新懸浮于磷酸鹽緩沖溶液中，制得培養(yǎng)液，測(cè)得OD600為0.8。按每瓶接種量1 mL接種培養(yǎng)液，30 ℃下150 r·min-1培養(yǎng)20 d。每12 h測(cè)定培養(yǎng)液的OD600，以ΔOD600(ΔOD600=OD600-0.8)表征總的微生物細(xì)胞生長(zhǎng)量。

1.5 根系及其分泌物對(duì)原油降解和脫氫酶活性的影響

考察根系及其分泌物對(duì)原油降解的影響，實(shí)驗(yàn)分3個(gè)處理：(a)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(b)菌株W+40 mL Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.1 g碎根；(c)菌株W+35 mL Bushell-Hass基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5 mL根系分泌物。

在4個(gè)三角瓶中加入0.02 g輕質(zhì)原油，121 ℃蒸汽滅菌15 min，留一瓶作空白，其余冷卻后分別加入根及其分泌物。按每瓶接種量1 mL接種培養(yǎng)液，30 ℃下150 r·min-1培養(yǎng)20 d。在第5 d、10 d、15 d、20 d按重量法測(cè)定殘余油量，計(jì)算原油的降解率。

測(cè)定菌液脫氫酶活性(DHA)，單位為μg TPF·mL-1·(6 h)-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 根系對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響(圖1)

圖1 加有3種植物根系的培養(yǎng)基ΔOD600隨時(shí)間的變化

從圖1可知，菌株W能夠利用3種植物碎根中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)為唯一碳源和能源，這驗(yàn)證了植物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)理論，即根際微生物可利用根系老化腐爛所釋放出的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而增殖，并強(qiáng)化根際污染物的降解。

在最初的12 h內(nèi)，各處理的ΔOD600分別從0增加到0.051(高羊茅)、0.056(黑麥草)、0.041(紫花苜蓿)。高羊茅和黑麥草根系處理的ΔOD600在36～48 h增加最快，之后達(dá)到穩(wěn)定期并有所下降。這是因?yàn)椋档臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是逐步釋放的，隨著微生物的生長(zhǎng)，根系在這一環(huán)境中開(kāi)始腐解而逐步釋放有機(jī)物，當(dāng)腐解所能釋放的有機(jī)物達(dá)到最大值時(shí)，微生物生長(zhǎng)急劇加快；隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，有機(jī)物量減少，微生物生長(zhǎng)又逐漸減緩。紫花苜蓿的ΔOD600突增期在48～60 h，比高羊茅和黑麥草的突增期推遲了12 h。這可能是因?yàn)椋匣ㄜ俎Ｏ刀箍浦参?，與同屬草本的高羊茅和黑麥草的根的理化性質(zhì)有異。

高羊茅和黑麥草的根毛遠(yuǎn)比紫花苜蓿的發(fā)達(dá)，這可能導(dǎo)致前者的根系在培養(yǎng)條件下腐解快于后者的根系。在栽培的植物中，根毛最多可貢獻(xiàn)高達(dá)77%的總根表面積[7]。根毛在植物生命進(jìn)程中也扮演了重要的角色，如固定植株、吸收水分和營(yíng)養(yǎng)、產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物-微生物聯(lián)系的物質(zhì)、調(diào)控植物生長(zhǎng)以及決定植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)[8～10]?；罡突钚猿跎按紊硇缘蒯尫糯罅扛捣置谖?。根據(jù)植物種類和經(jīng)受環(huán)境條件的不同，活根毛系統(tǒng)在根體系結(jié)構(gòu)(包括根毛數(shù)目和大小)方面差異很大。

需指出的是，由于不同種植物根系的有機(jī)物種類及含量不一致，因此不能因?yàn)槟撤N根系處理下的微生物生長(zhǎng)量比另一種根系處理下的更大，而認(rèn)為某種根系比另一種根系對(duì)微生物的生長(zhǎng)促進(jìn)作用更顯著。最終，各處理的ΔOD600最大值分別為0.185(高羊茅)、0.192(黑麥草)、0.158(紫花苜蓿)。

2.2 根系分泌物對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響(圖2)

圖2 加有3種植物根系分泌物的培養(yǎng)基ΔOD600隨時(shí)間的變化

由圖2可知，3種植物的根系分泌物也能支持微生物的生長(zhǎng)，且各處理樣的微生物生長(zhǎng)量在24 h時(shí)均達(dá)到頂峰，隨后下降。這主要是因?yàn)?，根系分泌物中的有機(jī)物都是溶解態(tài)的，可以迅速被微生物利用，而不像根系中的有機(jī)物需要靠腐解來(lái)逐步釋放。另外，可看到根系分泌物處理樣的微生物生長(zhǎng)量要小于根系處理樣的微生物生長(zhǎng)量，但不能由此判定根系對(duì)微生物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更大，因?yàn)樗尤氲母导捌浞置谖锼瑺I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的量不能確定一致。

2.3 根系對(duì)原油降解和脫氫酶活性的影響(圖3)

圖3 3種植物根系對(duì)原油累積降解率(a)和脫氫酶活性(b)的影響

由圖3可知，3種植物根系對(duì)原油降解同樣有促進(jìn)作用。第5 d的原油降解率分別為22.5%(未添加)、29.8%(高羊茅)、34.5%(黑麥草)、27.4%(紫花苜蓿)，與微生物生長(zhǎng)情況相似。此時(shí)，各處理間的原油降解率具有顯著差異(P<0.05)。5 d后，未添加與加有根系的處理樣間的原油降解率差距有一定程度的減小，這是因?yàn)? d時(shí)根系營(yíng)養(yǎng)物基本耗盡，導(dǎo)致對(duì)微生物的刺激作用減弱。因添加的根系已死亡，不可能對(duì)微生物產(chǎn)生持續(xù)性刺激。20 d時(shí)，原油降解率分別為47.6%(未添加)、60.5%(高羊茅)、61.2%(黑麥草)、54.8%(紫花苜蓿)。

由圖3還可知，根系可以提高脫氫酶的活性，這主要是有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的刺激作用所致。脫氫酶活性與原油降解基本呈正相關(guān)。

2.4 根系分泌物對(duì)原油降解和脫氫酶活性的影響(圖4)

圖4 3種植物根系分泌物對(duì)原油累積降解率(a)和脫氫酶活性(b)的影響

由圖4可知，3種植物根系分泌物促進(jìn)原油降解也是集中在前5 d，且促進(jìn)效果不如根系，與微生物生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)情況類似。第5 d的原油降解率分別為27.6%(高羊茅)、28.4%(黑麥草)、25.1%(紫花苜蓿)。高羊茅與黑麥草處理間差異不顯著，但與紫花苜蓿處理間有顯著差異(P<0.05)。20 d時(shí)，原油降解率分別為50.3%(高羊茅)、51.7%(黑麥草)、49.2%(紫花苜蓿)，要顯著低于加有相應(yīng)根系處理的原油降解率。

由圖4還可知，根系分泌物也能提高脫氫酶活性，但持續(xù)的時(shí)間不如根系，這主要是由于根系分泌物的營(yíng)養(yǎng)在開(kāi)始培養(yǎng)后很快就被微生物吸收消耗了。

3 結(jié)論

通過(guò)無(wú)土培養(yǎng)獲得植物(黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿)的根系及其分泌物，以搖瓶培養(yǎng)的方式考察了其對(duì)微生物生長(zhǎng)及活性的影響。結(jié)果表明，黑麥草、高羊茅及紫花苜蓿的根系及其分泌物均能支持微生物的生長(zhǎng)，并促進(jìn)原油的降解。黑麥草與高羊茅處理間的差異不顯著，但這兩種草本植物與紫花苜蓿處理間有顯著差異。根系對(duì)微生物生長(zhǎng)和原油降解的刺激效應(yīng)持續(xù)時(shí)間比根系分泌物的刺激效應(yīng)持續(xù)時(shí)間要長(zhǎng)。

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