劉晶芝，姜 雨

(1.河北師范大學旅游學院，河北 石家莊 050031；2.國家食品藥品監(jiān)督管理局保健食品審評中心，北京 100061)

大豆異黃酮(Soybean isoflavones)是存在于大豆中的一類重要的生物活性物質(zhì)，大豆異黃酮苷元主要包括大豆素(Daidzein)、染料木素(Genistein)和黃豆素(Glycitein)等，其中活性最強的為染料木素。染料木素結(jié)構(gòu)與雌二醇類似，能夠與雌激素受體結(jié)合，發(fā)揮雌激素作用，此外，還具有抗腫瘤、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等作用[1～3]。國內(nèi)外已批準多種含染料木素的異黃酮產(chǎn)品作為食品用于人群。

目前，染料木素的分離純化方法主要有三種：一是直接從不含大豆素和黃豆素的植物(如槐角、木豆根莖)中提取，但由于植物中染料木素含量低使得工藝復(fù)雜、成本高；二是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)染料木素，存在發(fā)酵周期長、純度低等問題；三是從染料木素含量較高的大豆異黃酮苷元混合物中分離，但由于大豆素和黃豆素的結(jié)構(gòu)與其類似，分離比較困難。文獻報道從大豆中分離高純度染料木素的方法有硅膠法、高速逆流色譜法等，存在反復(fù)上柱、操作繁瑣或處理量小等問題[4，5]。

作者在此采用聚合物納米微球?qū)Υ蠖巩慄S酮苷元混合物直接進行層析分離，并對聚合物納米微球型號、洗脫液體積分數(shù)、洗脫速度、載樣量等工藝條件進行了優(yōu)化。

1 實驗

1.1 試藥、試劑與儀器

80％大豆異黃酮苷元混合物(含28％染料木素)，市售；染料木素對照品(編號111704)，中國藥品生物制品檢定所；聚合物納米微球，蘇州納微科技公司；乙腈，色譜純，Merck公司。

中壓層析系統(tǒng)，瑞士Büchi公司；中壓層析柱(15 mm×230 mm和26 mm×460 mm)；高效液相色譜儀(515泵，996檢測器)，Waters公司。

1.2 HPLC色譜條件

色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫為室溫；流動相為乙腈-0.5％ TFA(35∶65)；流速1.0 mL·min-1；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

稱取染料木素對照品5 mg用甲醇溶解，配制成約500 μg·mL-1的標準儲備液；取一定量的標準儲備液用甲醇梯度稀釋，進行色譜分析，測定染料木素的色譜峰面積，染料木素在濃度為5～500 μg·mL-1時與峰面積有良好線性關(guān)系。

1.3 方法

用0.1 mol·L-1的NaOH溶液浸泡聚合物納米微球2 h，水洗至中性；然后用0.05 mol·L-1的HCl溶液浸泡2 h，水洗至中性；濕法裝柱。將大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入中壓層析柱頂端，用乙醇洗脫，分管收集，計算層析收率。合并純度大于98％(HPLC面積歸一法)的洗脫液，減壓濃縮至基本無乙醇，8 ℃放置2 h，過濾，水洗濾餅，真空干燥，得到染料木素粉末。

固定其它條件不變，分別考察聚合物納米微球型號、洗脫液體積分數(shù)、洗脫速度、載樣量(樣品與填料的質(zhì)量體積比，g∶mL，下同)對分離純化效果的影響，以確定最優(yōu)的分離純化條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物納米微球分離純化染料木素的工藝條件優(yōu)化

2.1.1 聚合物納米微球型號的確定

分別用型號為PS25-300、NM-MM100、PSA30-300的聚合物納米微球40 mL裝柱，將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入層析柱頂端，用60％(體積分數(shù)，下同)乙醇洗脫，洗脫速度為2 BV·h-1，每管收集5 mL，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結(jié)果見圖1。

圖1 聚合物納米微球型號對層析收率的影響

由圖1可看出，PS25-300型聚合物納米微球?qū)θ玖夏舅氐姆蛛x效果最好，層析收率最高。故選擇PS25-300型聚合物納米微球作為染料木素的層析介質(zhì)。

2.1.2 洗脫液體積分數(shù)的確定

將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物納米微球?qū)游鲋敹?，分別用體積分數(shù)為50％、60％、70％、80％的乙醇洗脫，洗脫速度2 BV·h-1，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結(jié)果見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對層析收率的影響

由圖2可看出，乙醇體積分數(shù)大于60％時，由于洗脫體積小，洗脫速度過快，染料木素和其它大豆苷元一起被洗脫，分離效果不好；當乙醇體積分數(shù)小于60％時，由于洗脫體積過大且拖尾現(xiàn)象嚴重，分離效果也不好；當乙醇體積分數(shù)為60％時，染料木素的分離效果最好，洗脫速度適中，層析收率高。故選擇洗脫液乙醇的體積分數(shù)為60％。

2.1.3 洗脫速度的確定

將0.2 g大豆異黃酮苷元混合物用甲醇溶解后注入PS25-300聚合物納米微球?qū)游鲋敹?，?0％的乙醇作為洗脫液，分別采用0.5 BV·h-1、1 BV·h-1、2 BV·h-1、4 BV·h-1、6 BV·h-1的洗脫速度進行洗脫，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫速度對層析收率的影響

由圖3可看出，洗脫速度過慢，易擴散，染料木素層析收率偏低；洗脫速度過快，洗脫不集中，染料木素與其它大豆苷元得不到有效分離，高純度染料木素的層析收率也不高；洗脫速度為2 BV·h-1時，高純度染料木素的層析收率最高。故選擇洗脫速度為2 BV·h-1。

2.1.4 載樣量的確定

分別按照1∶400、1∶300、1∶200、1∶100、1∶50的載樣量上樣，用60％乙醇洗脫，洗脫速度2 BV·h-1，HPLC檢測，合并純度大于98％的染料木素洗脫液，計算層析收率，結(jié)果見圖4。

圖4 載樣量對層析收率的影響

由圖4可看出，在保證分離效果的前提下，隨著染料木素載樣量的增加，染料木素的層析收率逐漸降低；當載樣量超過1∶200時，染料木素與其它苷元得不到有效分離，層析收率顯著下降(<50％)；載樣量在1∶400～1∶200時，層析收率較穩(wěn)定。考慮到成本因素，選擇載樣量為1∶200。

2.2 工藝驗證

在確定的最優(yōu)條件下，即以PS25-300型聚合物納米微球為分離介質(zhì)、洗脫液乙醇體積分數(shù)為60％、洗脫速度為2 BV·h-1、載樣量為1∶200(g∶mL)，在240 mL層析柱(26 mm×460 mm)上進行了3批驗證實驗，所得染料木素的HPLC圖譜見圖5。

由圖5結(jié)果計算可知，PS25-300型聚合物納米微球?qū)Υ蠖巩慄S酮苷元中的染料木素有很好的分離純化效果，平均層析收率大于75％、純度大于98％。

3 結(jié)論

以PS25-300型聚合物納米微球為分離介質(zhì)，將大豆異黃酮苷元用甲醇溶解后進行層析分離，用60％乙醇洗脫，洗脫速度控制在2 BV·h-1，載樣量為1∶200(g∶mL)，此時，層析收率大于75％、純度大于98％。該工藝過程簡單、易操作、產(chǎn)品收率高、質(zhì)量可控，可用于高純度染料木素的分離純化。

圖5 染料木素的HPLC圖譜

參考文獻：

[1] Guo J M，Xiao B X，Liu D H，et al.Biphasic effect of daidzein on cell growth of human colon cancer cells[J].Food Chem Toxicol,2004,42(10):1641-1646.

[2] Arjmandi B H，Smith B J.Soy isoflavones′ osteoprotective role in postmenopausal women:Mechanism of action[J].J Nutr Biochem，2002,13(3)：130-137.

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[5] Du Q Z，Li Z H，Ito Y.Preparative separation of isoflavone components in soybeans using high-speed counter-current chromatography[J].J Chromatogr A，2001,923(1-2):271-274.