歐陽蒲月，朱翠霞,陳功錫,鄧玲芳

(1.廣東食品藥品職業(yè)學(xué)院，廣東 廣州 510520；2.吉首大學(xué) 植物資源保護(hù)與利用湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 吉首 416000;3.南藥資源保護(hù)與利用工程技術(shù)開發(fā)中心，廣東 廣州 510520)

火炭母是蓼科(Polygonaceae)蓼屬(Polygonum)植物火炭母(PolygonumchinenseLinn.)的藥用全草,別名火炭毛、烏炭子、山蕎毒草、赤地利、老鼠蔗等,是民間常用的中草藥，廣泛分布于我國(guó)南部的福建、廣東、廣西和貴州等地區(qū)，生長(zhǎng)于水溝邊、山谷、濕地上。性涼，味微酸、澀，有清熱解毒、利濕止癢、明目退翳之效，臨床上主要用于濕熱泄瀉、痢疾、黃疸、咽喉腫痛、濕熱瘡疹、霉菌性陰道炎等病癥的治療[1,2]?；鹛磕盖o呈扁圓柱形,有分枝,長(zhǎng)30～100 cm,節(jié)稍膨大,下部節(jié)上有須根;表面淡綠色或紫褐色,無毛,有細(xì)棱;質(zhì)脆,易折斷,斷面灰黃色,多中空；托葉鞘呈筒狀,膜質(zhì),先端偏斜[1]。已有人用 10％的火炭母滴眼液治療角膜薄翳、角膜斑翳等眼疾[3]。火炭母中的藥用成分主要為黃酮、生物堿、芳香雜環(huán)類化合物等[4]。研究發(fā)現(xiàn)火炭母對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌和綠膿桿菌具有一定的體外抑菌活性[5]和體外抗腫瘤活性[6]，但其抑菌及抗腫瘤藥效物質(zhì)并不十分明確。

目前，對(duì)火炭母的生藥學(xué)研究已經(jīng)比較透徹,對(duì)其所含化學(xué)成分的研究也有一定進(jìn)展。作者在此對(duì)火炭母提取物的抑菌活性進(jìn)行研究，以期為提高火炭母的藥用價(jià)值以及后續(xù)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料

火炭母地上部分采自湘西自治州吉首大學(xué)后山，由吉首大學(xué)陳功錫教授鑒定為火炭母。室溫陰干，將葉與莖分離，65 ℃烘干，分別粉碎，過100目篩。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草桿菌(Bacillussubtilis)、痢疾桿菌(Shigelladysenteriae)、藤黃球菌(Micrococcusluteus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、白色念珠菌(Moniliaalbicans)，湖南省疾病預(yù)防控制中心。細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)24 h，以試管斜面培養(yǎng)基保存；真菌在29 ℃培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)接到培養(yǎng)皿中，保存，備用。

1.1.2 試劑

95％乙醇、無水甲醇、石油醚、乙醚、濃鹽酸、硼酸、氨水、NaOH、瓊脂、牛肉膏、蛋白胨，均為國(guó)產(chǎn)分析純；黃連素，市售，四川亞寶光泰藥業(yè)有限公司。

1.1.3 儀器

RE540 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Yamato；HM-205TOA型pH計(jì)；FD-1型冷凍干燥機(jī)；PW/10-002型培養(yǎng)箱；CCV-1311型超凈工作臺(tái)；SM-52型高壓蒸汽滅菌器；AEG-220型分析天平；索氏提取器。

1.2 方法

1.2.1 抑菌活性物質(zhì)的提取

1.2.1.1 不同部位提取物

取不同部位材料各5 g，分別加入65％、95％乙醇溶液100 mL，先超聲提取30 min，然后45 ℃水浴30 min，趁熱過濾，濃縮至5 mL，得不同部位提取物(生藥濃度為1.0 g·mL-1)。

1.2.1.2 不同溶劑提取物

取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，分別用蒸餾水、無水甲醇、65％乙醇、95％乙醇作溶劑，按1.2.1.1方法提取，得不同溶劑提取物。

1.2.1.3 不同提取方法提取物

超聲提取物按1.2.1.1得到。

索氏提取物：取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料5 g，裝入索氏提取器的濾紙?zhí)淄仓?，加?00 mL 65％乙醇溶液，加沸石數(shù)粒，于80 ℃水浴加熱回流提取5 h，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容至5 mL，即得。

1.2.1.4 不同溶劑萃取物

稱取1.2.1.1中抑菌效果最佳部位材料50 g，加入最佳提取溶劑500 mL，按1.2.1.1方法提取，重復(fù)1次，合并濾液，濃縮至50 mL，使生藥濃度為1.0 g·mL-1。濾液分別用石油醚、乙醚萃取(加萃取劑50 mL，混勻，靜置30 min)，取上層液，下層液再用萃取劑重復(fù)萃取2次，合并萃取液，得到石油醚萃取物、乙醚萃取物，濃縮，以甲醇定容至50 mL，即得不同溶劑萃取物(生藥濃度為1.0 g·mL-1)。

1.2.2 抑菌活性測(cè)定

1.2.2.1 對(duì)細(xì)菌的抑菌活性測(cè)定

(1)含藥濾紙片的準(zhǔn)備

用打孔器將定性濾紙打成直徑為5 mm的小圓片，置培養(yǎng)皿內(nèi)高壓滅菌后，分別浸泡于不同供試藥液中，備用。陰性對(duì)照浸泡無菌水，陽性對(duì)照浸泡黃連素溶液。

(2)接種

用竹簽挑取細(xì)菌放入無菌水中成稀釋菌液，用移液器吸取120 μL稀釋菌液滴在直徑為9 cm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平皿中央，用玻璃刮鏟將菌液均勻地涂布于整個(gè)平皿，于培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)10～15 min至培養(yǎng)基表面干燥后，分別將含藥濾紙片均勻地放置在接種了不同受試菌的培養(yǎng)基表面(每皿放4片含藥濾紙片)，稍加按壓使之緊貼培養(yǎng)基。37 ℃培養(yǎng)24 h后，取出平皿，測(cè)量各紙片周圍抑菌圈直徑。

1.2.2.2 對(duì)真菌的抑菌活性測(cè)定

(1)含毒培養(yǎng)基的制備

在無菌條件下，取提取物5 mL、10 mL分別加入到25 mL 50 ℃左右的培養(yǎng)基中，充分振蕩混勻后倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中。每濃度做2個(gè)重復(fù)，每種菌株抑菌實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。對(duì)照培養(yǎng)基為空白培養(yǎng)基，即不加任何提取物，只加相應(yīng)體積的無菌水。

(2)接種培養(yǎng)

取培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5～7 d(菌絲均勻布滿培養(yǎng)基表面)的供試菌種，用直徑為5 mm的無菌玻璃管在菌落邊緣切取帶菌培養(yǎng)基(菌餅)，用接種針將菌餅分別接種至冷卻后的含毒培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿接種菌餅1塊，置28 ℃的生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d，待對(duì)照培養(yǎng)基中的菌絲體充分生長(zhǎng)后(孢子不成熟)，測(cè)量處理組和對(duì)照組菌落直徑(按十字交叉法測(cè)量菌落直徑2次，取其平均值)，按下式計(jì)算抑菌率：

1.2.3 最小抑菌濃度(MIC)與最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

取1.2.1中抑菌效果最佳提取物制成含生藥濃度分別為4.0 g·mL-1、2.0 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.8 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.4 g·mL-1、0.2 g·mL-1、0.1 g·mL-1、0.05 g·mL-1的試液，取各濃度試液0.1 mL加入到0.8 mL的液體培養(yǎng)基中，接入0.1 mL菌懸液，搖勻，于37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。若液體培養(yǎng)基完全清亮，表示無細(xì)菌生長(zhǎng)，無細(xì)菌生長(zhǎng)的最小生藥濃度為最小抑菌濃度(MIC)。另設(shè)未加菌液為空白對(duì)照、黃連素為陽性對(duì)照。

從無細(xì)菌生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基中取出0.1 mL涂布平板，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，觀察有無細(xì)菌生長(zhǎng)。無細(xì)菌生長(zhǎng)的最小生藥濃度為最小殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同部位提取物的抑菌活性(表1)

由表1可知， 火炭母的葉與莖提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、 藤黃球菌有一定的抑制作用，其中葉提取物的抑制作用更強(qiáng)；火炭母對(duì)黑曲霉無抑制作用，但對(duì)白色念珠菌的抑制作用卻很好，這可能是因?yàn)榛鹛磕笇?duì)黑曲霉和白色念珠菌的抑制作用機(jī)制不同而造成的。

表1 火炭母不同部位提取物的抑菌活性比較

2.2 不同溶劑提取物的抑菌活性

不同溶劑提取火炭母的葉粉末所得到的提取物的抑菌活性比較見表2。

表2 不同溶劑提取物的抑菌活性比較

由表2可知，65％乙醇提取物對(duì)各菌的抑制作用最強(qiáng)；無水甲醇提取物次之；95％乙醇提取物再次之；蒸餾水提取物最弱。由此推測(cè)：火炭母的抑菌活性物質(zhì)可能具有表面活性，醇濃度太高或者用蒸餾水(不含醇類基團(tuán))都不利于其溶解釋出。

各菌的敏感性由強(qiáng)到弱依次為：金黃色葡萄球菌>白色念珠菌>痢疾桿菌>藤黃球菌>枯草桿菌。這與李少基等[5]的研究結(jié)果相似。

2.3 不同提取方法提取物的抑菌活性(表3)

表3 不同提取方法提取物的抑菌活性比較

由表3可知，超聲提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、白色念珠菌的抑制作用較索氏提取物強(qiáng)；但對(duì)于枯草桿菌、藤黃球菌的抑制作用卻相當(dāng)，這說明超聲提取和索氏提取對(duì)這兩種菌的有效抑菌成分的提取效果相當(dāng)。從整體來看，超聲提取物抑菌效果較強(qiáng)，這與黃國(guó)霞等[7]的研究結(jié)果相似。這表明提取時(shí)間、溶劑浸泡時(shí)間可能對(duì)抑菌活性物質(zhì)的提取沒有多大影響；也有可能在索氏提取過程中提取出來了一些與抑菌活性物質(zhì)相互影響的化學(xué)成分，影響了抑菌效果。

2.4 不同溶劑萃取物的抑菌活性(表4)

由表4可知，乙醚萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、藤黃球菌、痢疾桿菌、白色念珠菌的抑制作用較強(qiáng)，遠(yuǎn)大于陽性對(duì)照黃連素；石油醚萃取物對(duì)以上5種菌也有一定的抑制作用；乙醚萃取物和石油醚萃取物對(duì)黑曲霉均無抑制作用；萃余物對(duì)各菌均無抑制作用。這些表明火炭母的抑菌活性物質(zhì)易溶于非極性溶劑。乙醚對(duì)減弱抑菌活性的貢獻(xiàn)最大，石油醚次之，這兩種溶劑能夠?qū)⒁志钚晕镔|(zhì)萃取完全。因此，提取抑菌成分時(shí)，應(yīng)選用這類非極性溶劑。

2.5 最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)(表5)

表4 不同溶劑萃取物的抑菌活性比較

由表5可知，火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、 藤黃球菌、白色念珠菌的最小抑菌濃度(g·mL-1)分別為0.6、0.6、0.8、1.0、0.6；對(duì)5種菌的最小殺菌濃度均為1.0 g·mL-1。

表5 火炭母提取物的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

3 結(jié)論

對(duì)火炭母提取物的抑菌活性進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)火炭母的抑菌活性物質(zhì)存在于葉和莖中，但葉提取物的抑菌活性更高；(2)不同溶劑提取物中，65％乙醇提取物具有最高的抑菌活性；(3)超聲提取物的抑菌效果較索氏提取物稍強(qiáng)；(4)提取物中的抑菌活性成分易溶于乙醚、石油醚等非極性溶劑；(5)火炭母提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草桿菌、藤黃球菌、白色念珠菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.6 g·mL-1、0.6 g·mL-1、0.8 g·mL-1、1.0 g·mL-1、0.6 g·mL-1，最小殺菌濃度(MBC)均為1.0 g·mL-1。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局.中華本草(第二卷)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1999：647-649.

[2] 任國(guó)珍，何世東.火炭母復(fù)方為主治療小兒急性細(xì)菌性痢疾52例[J].廣西中醫(yī)藥，2001，24(1):32.

[3] 徐國(guó)鈞，何宏賢．中國(guó)藥材學(xué)(下冊(cè))[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996：1371.

[4] 謝賢強(qiáng)，吳萍，林立東，等.火炭母化學(xué)成分的研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào),2007，15(5)：450-454.

[5] 李少基，陳武，陳足金，等.12種中草藥的體外抑菌試驗(yàn)[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2004，(1):44.

[6] 韋金育，李延，韋濤，等.50種廣西常用中草藥、壯藥抗腫廇作用的篩選研究[J].廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003，6(4):3-7.

[7] 黃國(guó)霞,劉柳,汪青,等.火炭母有效成分的提取及抗氧化活性研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001，50(12):2490-2492.