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        間接競爭ELISA法檢測飼料中鹽酸克倫特羅的探討

        2012-05-03 10:15:42劉立波
        飼料博覽 2012年6期
        關(guān)鍵詞:倫特羅鹽酸回收率

        劉立波

        (河北唐縣農(nóng)業(yè)局,河北 唐縣 072350)

        鹽酸克倫特羅(CLB)又稱鹽酸雙氯醇氨、氨哮素、克喘素,化學名稱為α-([叔丁氨基)甲基]-4-氨基-3,5-二氯苯甲醇鹽酸鹽[1]。CLB主要用于治療人和家畜的支氣管哮喘,但其對人體有很強的副作用,其半衰期長,在體內(nèi)代謝慢,極易積蓄在肝臟、腎臟等器官中。中毒表現(xiàn)主要為肌肉震顫、頭疼、心悸等。同時CLB具有蛋白質(zhì)同化作用,在動物體內(nèi)代謝過程中促進骨骼肌蛋白質(zhì)的合成,對脂肪的合成有一定的抑制作用,可以減少脂肪的形成,提高瘦肉率[2]。因此,一段時間以來CLB被作為一種促生長添加劑而倍受重視。

        不法飼料生產(chǎn)商和養(yǎng)殖戶將CLB加入到飼料或飲用水中,用以促進生豬、牛、羊的生長,提高瘦肉率。通過飼喂會使其殘留在動物的內(nèi)臟及肌肉組織中,人類食用殘留CLB的動物產(chǎn)品發(fā)生中毒,通常表現(xiàn)為面色潮紅、頭痛、胸悶、心悸、心慌、骨骼肌震顫、四肢麻木等一系列不良反應。對心律失常、高血壓、青光眼、糖尿病、甲狀腺機能亢進、前列腺肥大等疾病的患者有較大的危害甚至危及生命[3]。故當前我國立法禁止將鹽酸克倫特羅作為飼料藥物添加劑使用。加強對飼料產(chǎn)品中CLB的監(jiān)測,可以保障食品安全,從而保護人的建康與安全。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        選擇飼料樣本16份作為試驗材料,其中8份來自經(jīng)過河北省飼料檢測中心檢測的不含鹽酸克倫特羅的樣本,另外8份來自于銷售市場的隨機抽樣。

        1.2 主要儀器和試劑

        酶標儀;微量移液器(20、50、100μL);96孔酶標板1塊(包被有偶聯(lián)抗原);標準液6瓶:(1 mL/瓶)0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb;高濃度標準品:100 ppb 1mL;酶標二抗7mL;克倫特羅抗體工作液7mL;底物液A液、B液(TMB底物溶液)各7mL;終止液7mL;20×濃縮洗滌液40mL。

        1.3 檢測原理

        鹽酸克倫特羅間接競爭ELISA檢測試劑盒基于間接競爭性酶聯(lián)反應原理,在酶標板微孔板上預包被偶聯(lián)抗原,樣本中殘留的CLB和微孔板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗CLB抗體,加入酶標二抗后,用底物顯色,樣本吸光度值與其所含殘留物鹽酸克侖特羅的含量成負相關(guān),與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)即可得出樣品中CLB的含量[4]。

        1.4 試驗方法

        1.4.1 樣品中鹽酸克倫特羅的提取

        將飼料樣本用研缽研碎,用電子天平稱取粉碎的樣本2.0 g,然后將此樣本加入50mL離心管中,加入2mol·L-1的鹽酸溶液中,加入蒸餾水16mL,用力反復搖晃,然后放置超聲波水浴中超聲30 min。用3 000 rpm離心20min,取出上清液加入氫氧化鈉溶液2mL(1mol·L-1)混合均勻,將pH調(diào)至6.5~7.5,3 000 rpm離心20min,取100μL上清液和900μL蒸餾水混合,取用20μL備用。

        1.4.2 樣品中鹽酸克倫特羅的測定

        依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY-T1460-2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯(lián)免疫吸附法》方法測定[5]。

        1.5 標準曲線制備

        將6個濃度的鹽酸克倫特羅的標準溶液(0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1 ppb)和待測溶液按限量法測定步驟測定相應的吸光度值。百分吸光率的計算法見式(1)。

        B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

        B0—0 ppb標準溶液的平均吸光度值

        以百分吸光率為縱坐標,以克侖特羅標準品濃度(ppb)的半對數(shù)為橫坐標,繪制標準曲線。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結(jié)果

        飼料樣品中鹽酸克侖特羅的測定結(jié)果見表1。

        表1 飼料樣本檢測結(jié)果

        依據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY-T438-2001《飼料中鹽酸克倫特羅的測定》,中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY-T1460-2007《飼料中鹽酸克倫特羅的測定酶聯(lián)免疫吸附法》,中華人民共和國國家標準GB/T22147-2008《飼料中沙丁胺醇,萊克多巴胺,鹽酸克倫特羅的測定液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法》中規(guī)定CLB檢測限為0.01mg·kg-1,CLB定量限為0.05mg·kg-1,飼料在處理過程中被稀釋100倍,表1中檢測樣1~6是測定飼料中添加CLB用以測定回收率,樣本7~17是抽檢的飼料樣本,可以看出,目前市場上的飼料產(chǎn)品中沒有添加違禁藥物CLB,飼料的質(zhì)量安全可靠[5-6]。

        2.2 樣品陽性添加物回收率

        在經(jīng)本方法測定過的不同飼料樣本中準確加入一定量的鹽酸克倫特羅,按同樣的操作過程提取、測定,計算回收率。平均回收率為96.9%。陽性添加物回收率結(jié)果見表2。

        表2 陽性添加物回收率

        通過表2可以看出,陽性添加回收率平均達到96.9%,符合試劑盒中所規(guī)定的85%~95%的回收率數(shù)值,表明此次檢測準確可靠。賈濤研究表明,酶聯(lián)免疫方法具有操作簡便、靈敏度高、成本低的優(yōu)點,鹽酸克倫特羅酶朕免疫反應測試盒為養(yǎng)殖者和政府監(jiān)督管理部門提供了更準確快速檢測克倫特羅殘留的方法,該試劑盒的提取方法能達到75%~95%的回收率,可以不需用有機溶劑并在10~30min完成提取過程。該法具有靈敏度高(0.05 ng·g-1)、檢測下限低(肉類/脂肪 0.025 ng·g-1、尿液 0.05 ng·mL-1、飼料0.2 μg·kg-1)、檢測時間≤2 h;重復性高的特點[7]。

        3 結(jié)論

        間接競爭ELISA法可以直接用于測定飼料中鹽酸克倫特羅含量,具有良好的靈敏度和穩(wěn)定性。

        [1]陳啟佳.鹽酸克倫特羅在肉制品中的危害及其檢測方法研究進展[J].肉類研究,2011(6):58-60.

        [2]王海花,黃素珍.鹽酸克倫特羅的危害性與檢測[J].動物醫(yī)學進展,2003(4):41-43.

        [3]翟福麗,賴克強,張衍亮,等.動物性食品中β-興奮劑殘留概述[J].食品科學,2011(5):351-356.

        [4]Jiang JQ,Zhang H T,Wang Z L.Preparation and Identification ofanti-RactopamineMonoclonalantibodies[J].IPCBEE,2011(3):78-81.

        [5]中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準.NY-T1460-2007飼料中鹽酸克倫特羅的測定.酶聯(lián)免疫吸附法[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2008.

        [6]中華人民共和國國家標準.GB/T22147-2008飼料中沙丁胺醇,萊克多巴胺,鹽酸克倫特羅的測定.液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[S].北京:中國標準出版社,2008.

        [7]賈濤.酶聯(lián)免疫法檢測鹽酸克倫特羅的試驗報告[J].北京農(nóng)業(yè),2007,33:47-54.

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