張北平　劉樹(shù)鋒　王　?！∽T　校（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科　韶關(guān)　512026）

γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠腎組織表達(dá)研究

張北平劉樹(shù)鋒王海譚校（汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬粵北人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科韶關(guān)512026）

摘要：目的：對(duì)狼瘡小鼠腎組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表達(dá)水平進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)γ-GCS的表達(dá)量改變?cè)谵D(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）促纖維化中的作用。方法：以C57BL/6小鼠為對(duì)照，熒光定量PCR法檢測(cè)MRL/1pr雌性小鼠腎組織γ-GCS和TGF-β1的mRNA表達(dá)。結(jié)果：狼瘡小鼠組腎組織中γ-GCS的mRNA及蛋白表達(dá)減少，TGF-β1的mRNA表達(dá)水平升高，與C57BL/6小鼠組比較有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)論：γ-GCS表達(dá)降低導(dǎo)致谷胱甘肽（GSH）合成減少，抗氧化能力減弱，促使腎間質(zhì)纖維化。

關(guān)鍵詞：狼瘡性腎炎 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統(tǒng)的疾病，狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是最常見(jiàn)器官損害，免疫損傷聯(lián)合炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎組織中活性氧簇含量增加［1］，同時(shí)抗氧化劑GSH含量減少，氧化-抗氧化失衡造成組織損害，最終發(fā)展到腎間質(zhì)纖維化的不可逆性損害。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β1）與LN腎間質(zhì)纖維化過(guò)程中最重要的促纖維化因子，表達(dá)影響著腎組織的纖維化進(jìn)展。谷胱甘肽（GSH）是機(jī)體最重要的抗氧化損害物質(zhì)，在LN中起到重要作用，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）為合成GSH的關(guān)鍵限速酶，γ-GCS的活性和表達(dá)水平直接影響GSH的水平，是維持細(xì)胞內(nèi)GSH穩(wěn)態(tài)的主要決定因素。本研究在MRL/1pr雌性小鼠模型中，從轉(zhuǎn)錄水平研究TGF-β1和γ-GCS在狼瘡鼠腎組織的表達(dá)，探討GSH合成限速酶γ-GCS在MRL/1pr的表達(dá)在LN腎氧化應(yīng)激及間質(zhì)纖維化中的作用。

1資料與方法

1.1研究資料：正常組小鼠：SPF級(jí)C57BL/6小鼠；自發(fā)性狼瘡性腎炎模型組：MRL/1pr雌性小鼠，各10只，均為雌性。

1.2實(shí)驗(yàn)方法：試劑Trizol Reagent（Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒（寶生物工程有限公司），PCR引物合成（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。兩組小鼠培養(yǎng)至16周時(shí)斷頸處死，無(wú)菌環(huán)境下取出腎臟，用Trizol Reagent分別提取兩組小鼠腎組織總RNA（按照試劑盒方法操作）。用熒光定量PCR方法檢測(cè)總RNA中TGF-β1、γ-GCS的mRNA水平，反應(yīng)按照試劑盒說(shuō)明采用2步法完成。設(shè)計(jì)引物：內(nèi)參GAPDH（150bp）F：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，R：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG；TGFβ1 （92bp）F：TTTCCGCTGCTACTGCAAGTC，R：AGGGCTGTCTGGAGTCCTCA；γ-GCS（132bp）F：TGCACATCTACCACGCAGTCAA，R：GAACATCGCCTCCATTCAGTAACA，實(shí)驗(yàn)條件 95℃5min→94℃10s→59℃，33個(gè)循環(huán)。以稀釋的cDNA濃度梯度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表1）

TGF-β1半定量PCR結(jié)果：狼瘡組TGF-β1mRNA的表達(dá)高于正常組（P＜0.05）。狼瘡組γ-GCS的mRNA表達(dá)較正常組減少（P＜0.05）。

3討論

表1

腎間質(zhì)纖維化是LN發(fā)展到終末期的表現(xiàn)，是SLE最常見(jiàn)死亡原因。多項(xiàng)研究認(rèn)為，LN腎組織內(nèi)大量氧自由基通過(guò)多種途徑造成腎組織損害，這種損害和患者機(jī)體GSH降低有關(guān)［2］。研究認(rèn)為L(zhǎng)N腎組織TGF-β1過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致了腎間質(zhì)纖維化。研究表明小鼠胚胎成纖維細(xì)胞GSH可以阻斷TGF-β1引起的纖溶酶原激活物抑制物-1mRNA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解；狼瘡患者體內(nèi)GSH水平下降，是機(jī)體內(nèi)氧化-抗氧化失衡的主要原因，其降低水平和疾病活動(dòng)有相關(guān)性［4］，這個(gè)結(jié)論與本項(xiàng)研究中GSH合成限速酶γ-GCS表達(dá)降低（P＜0.05）的結(jié)果是一致的。γ-GCS的mRNA表達(dá)降低，必然導(dǎo)致GSH水平降低。因此認(rèn)為，SLE患者體內(nèi)GSH降低是消耗增加和產(chǎn)生減少共同導(dǎo)致的。目前考慮炎癥損傷及免疫學(xué)損害使腎組織GSH消耗并γ-GCS表達(dá)減少，氧化損害加劇導(dǎo)致纖維化因子TGF-β1過(guò)度表達(dá)，腎間質(zhì)纖維化。

綜上，GSH在狼瘡性腎炎發(fā)展到纖維化過(guò)程中有重要作用［5］，本研究認(rèn)為γ-GCS在MRL/1pr小鼠腎組織表達(dá)減少可能是導(dǎo)致腎組織GSH降低的根本原因，也是LN腎組織氧化應(yīng)激加重的重要原因，外源性補(bǔ)充GSH或增強(qiáng)表達(dá)γ-GCS可從根本上提高腎組織GSH水平，可能減緩腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程。

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中圖分類(lèi)號(hào)：R593.24+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1672-8351（2016）07-0133-01