畢迎春 李蕓 金作林

[摘要]目的：檢測不同濃度TNF- 對體外培養(yǎng)人牙囊細(xì)胞增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。方法：第5代人牙囊細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，分別與不同濃度的TNF- 共同孵育，檢測TNF-對人牙囊細(xì)胞的增殖活性和堿性磷酸酶活性的影響。結(jié)果：TNF-在濃度為10～50ng/ml，時(shí)間為3天時(shí)促進(jìn)人牙囊細(xì)胞的增殖，濃度為10～200ng/ml時(shí)抑制堿性磷酸酶活性。結(jié)論：TNF-在特定的濃度和時(shí)間促進(jìn)人牙囊細(xì)胞的增殖，抑制牙囊細(xì)胞的成骨特性。

[關(guān)鍵詞]牙囊細(xì)胞；腫瘤壞死因子－α；增殖；堿性磷酸酶

[中圖分類號]Q813.1[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號]1008-6455（2012）01-0071-03

Effects of TNF-α on the proliferation and alkaline phosphatase of the human dental follicle cells

BI Ying-chun1,Li Yun2,JIN Zuo-lin3

（1.Department of Stomatology,General Hospital of Jinan Military Area Command of Chinese PLA,Jinan 250031,Shandong,China;2.Department of Stomatology,210 Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinese PLA；3.Department of Orthodontics,College of Stomatology,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China）

Abstract:ObjectiveTo study the effects of different concentration TNF-α on theactivity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells.MethodsThe 5th passage human dental follicle cells were seeded on 96-well plates and co-cultured with different concentration of TNF-α, the activity of proliferation and the activity of alkaline phosphatase was assayed.ResultsThe 10～50ng/ml TNF-α enhanced the activity of proliferation profoundly and the effects were significant at 3 days after co-culture. 10～200ng/ml TNF-α decreased the activity of alkaline phosphatase.ConclusionsTNF-α enhance the activity of proliferation and decreased the activity of alkaline phosphatase of human dental follicle cells at special concentration and time.

Key words:dental follicle cell; Tumor necrosis factor-α; proliferation; ALP activity

牙囊組織起源于外胚間充質(zhì)，是包繞成釉器周圍的疏松結(jié)締組織，在牙齒萌出和牙周組織形成中起重要作用，缺乏牙囊的牙齒不能萌出，牙囊組織調(diào)節(jié)各種因子，如TNF-α、IL-10[1]、RANKLE等，吸引外周血中的單核細(xì)胞進(jìn)入牙囊，融合成破骨細(xì)胞。TNF-α[2]第三天在大鼠牙囊中有微弱的表達(dá)，至第9天達(dá)到高峰，與第10天形成的破骨細(xì)胞高峰期有密切關(guān)系，TNF-α參與牙齒萌出的因子調(diào)節(jié)，是牙齒萌出過程中的重要因子。而TNF-α對人牙囊細(xì)胞的增殖的研究未見報(bào)道，這對TNF-α對人牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的影響有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1材料和方法

1.1 主要試劑與儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone，USA)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物材料有限公司)；胰蛋白酶(GIBCO公司，進(jìn)口分裝)；TNF-α(Peprotech公司，USA)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NUCO，USA)；噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，USA)；二甲基亞砜(DMSO，上海東風(fēng)試劑廠)； 堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物試劑公司)；噻唑藍(lán)(MTT，Sigma，USA)； CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Forma Scientific 公司，USA)；YJ-875型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備廠)；DG-3022型酶聯(lián)免疫儀(南京華東電子儀器廠)。

1.2 人牙囊細(xì)胞的體外培養(yǎng)：取12歲因正畸需要拔除的下頜第三磨牙的牙囊組織,用含雙抗的PBS 液沖洗3遍,切成1mm×1mm×1mm的組織塊,離心收集組織塊,625U/ml膠原酶消化40min,離心900r/min×6min,收集細(xì)胞和碎組織塊加入0.5ml含10%新生牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)液(含雙抗),接種到6孔板上,37℃,5%CO2孵育,3h 后加入培養(yǎng)液,5天后更換,以后每3天換液一次。5～10天可見細(xì)胞從組織塊爬出,15～20天待細(xì)胞長至80%,用0.25%胰酶消化傳代,利用細(xì)胞對胰蛋白酶消化時(shí)間的不同,可排除上皮細(xì)胞的混雜,達(dá)到純化牙囊細(xì)胞的目的,約傳代2次即可純化細(xì)胞。取3～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs增殖的濃度效應(yīng)：取第3～6 代人牙囊細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后，配成單細(xì)胞懸液，以每孔1 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板上，每孔加5%FBS的DMEM 200μl，次日去除未貼壁死細(xì)胞，換含1% FBS 的DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)分別加濃度為5、10、25、50、100、200ng/ml的TNF-α，對照組不加IL-1α，每組4 孔，第4天終止培養(yǎng)，每孔加MTT溶液20μl(5mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4h，終止孵育，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加150μl DMSO，振蕩10min、490nm 波長處酶聯(lián)免疫儀上測各孔光吸收值，記錄結(jié)果并進(jìn)行方差分析。

1.4TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs增殖的時(shí)間效應(yīng)：按1.3的方法準(zhǔn)備細(xì)胞，換含1% FBS 的DMEM 同時(shí)加空白對照組，實(shí)驗(yàn)組加入TNF-α10ng/ml分別在1、3、5、7天 終止培養(yǎng)，每組4孔，每孔加MTT溶液20μl(5 mg/ml)，37℃繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，吸棄培養(yǎng)液，每孔加150μl的DMSO，振蕩10min，490nm 波長處酶聯(lián)免疫儀上測各孔光吸收值，記錄結(jié)果并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.5 TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs的ALP的影響： 取生長良好的第5代人牙囊細(xì)胞用2.5g/l 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/l FBS 的DMEM培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，以每孔103細(xì)胞接種到96孔板上，每孔體積為200μl，次日去除未貼壁死細(xì)胞，換含10ml/l FBS 的DMEM培養(yǎng)液，加入TNF-α濃度分別為0、5、10、25、50、100、200ng/ml，每組8孔，每3天 換液一次。于加液后5天 終止培養(yǎng)，其中4孔用作MTT檢測細(xì)胞增殖，另4孔用pH7.4的PBS洗3遍吸干，每孔加入1ml/L Triton X-100 50μl，置4℃冰箱過夜，然后加入堿性磷酸酶底物，每孔100μl，37℃孵箱內(nèi)置30min，以0.2mol/L NaOH 50μl/孔，終止反應(yīng)，在酶聯(lián)免疫檢測儀上在410nm波長處測各孔A值，計(jì)算ALP/MTT的比值(A410/A490)間接反映細(xì)胞堿性磷酸酶活性，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有計(jì)量資料均以x±s表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，與對照組之間差異比較P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs增殖的濃度效應(yīng)：TNF-α對牙囊細(xì)胞的增殖具有輕度促進(jìn)作用，在10ng/ml時(shí)對牙囊細(xì)胞開始有促增殖作用，在50ng/ml時(shí)達(dá)到最高峰(P<0.05)，當(dāng)濃度增大至100ng/ml時(shí)，對牙囊細(xì)胞的增殖無明顯促進(jìn)作用(P>0.05)(見表1)。

2.2 TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs增殖的時(shí)間效應(yīng)：選用10ng/ml的TNF-α，僅在第3天對牙囊細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用(P<0.05)，在的5天和第7天促增值作用不明顯，與對照組無明顯差異(P>0.05)(見表2)

2.3TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs的ALP的影響：見表3，可看出，TNF-α對體外培養(yǎng)的HDFCs的堿性磷酸酶的表達(dá)有抑制作用，在濃度大于10ng/ml時(shí)，與對照組(濃度為0ng/ml)有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

細(xì)胞增殖是檢測外界因素對細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的一個(gè)重要手段，它反映了細(xì)胞在受到外界環(huán)境因素作用后，自身發(fā)生變化的情況。TNF-α在牙齒萌出過程中具有重要作用，是調(diào)控牙齒發(fā)育和萌出的細(xì)胞因子，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)TNF-α在濃度為10～50ng/ml時(shí)具有促進(jìn)HDFCs增殖的作用，在時(shí)間效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中，10ng/ml的TNF-α在第三天時(shí)具有促進(jìn)增殖的作用，隨后5天、7天的作用并不明顯，說明過高的因子濃度并不能引起相應(yīng)的細(xì)胞增殖，也說明了細(xì)胞對某種因子的敏感濃度有一定的范圍，超過這一范圍，細(xì)胞將不敏感，甚至有毒副作用，引起細(xì)胞狀態(tài)不佳甚至死亡。

TNF-α對人牙囊細(xì)胞的增殖的研究未見報(bào)道，但TNF-α在大鼠的牙囊組織中有表達(dá)[2]，且與牙齒萌出過程中的破骨細(xì)胞的形成有關(guān)，因而推測某種濃度范圍內(nèi)的TNF-α對牙囊細(xì)胞有促增殖作用，以往的研究也證實(shí)TNF-α可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[3]，而牙囊細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)，具有成纖維細(xì)胞的特性，二者的生物學(xué)特性有某些相似處。

堿性磷酸酶(ALP)是參與骨等硬組織形成、代謝、再生的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，又是細(xì)胞分化成熟和成骨能力的標(biāo)志之一， 堿性磷酸酶是與鈣化組織形成密切相關(guān)的一種物質(zhì)，是向成骨細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志。堿性磷酸酶廣泛分布于體內(nèi)幾乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通過水解磷酸酯、破壞礦化抑制劑及作為鈣結(jié)合蛋白和磷酸基的轉(zhuǎn)運(yùn)子而促進(jìn)礦化，作為生物礦化和成骨樣細(xì)胞的特征性標(biāo)記。它的表達(dá)代表骨形成狀況，表明細(xì)胞分化的開始，并隨細(xì)胞分化的發(fā)展而增強(qiáng)，其活性的高低可反映相應(yīng)細(xì)胞向成骨方向轉(zhuǎn)化的趨勢。

本實(shí)驗(yàn)所采用的ALP活性檢測法是利用ALP可催化對硝基苯磷酸鹽水解為對硝基苯酚和磷酸鹽，而產(chǎn)生可間接反應(yīng)ALP活性的對硝基苯酚的量，與在410nm波長測得的A值呈正相關(guān)。

牙囊細(xì)胞源于外胚間充質(zhì)，是具有多向分化潛能的細(xì)胞群，含有發(fā)育成牙周組織的前體細(xì)胞。Handa等[4]通過體外培養(yǎng)牛牙囊細(xì)胞并提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，細(xì)胞表達(dá)低水平的堿性磷酸酶。王湞等[5]在體外培養(yǎng)的人胚胎牙囊細(xì)胞中檢測到堿性磷酸酶mRNA的低水平表達(dá)。張永寬[6]等用礦化液處理牙囊細(xì)胞后，ALP的活性增強(qiáng)，Zhao M等[7]的研究表明體外培養(yǎng)的永生化的鼠牙囊細(xì)胞在rhBMP-2誘導(dǎo)下可以向成骨細(xì)胞/成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型分化， rhBMP-2能增強(qiáng)骨鈣蛋白、骨涎蛋白的表達(dá)，說明牙囊細(xì)胞具有向成骨樣細(xì)胞分化的潛能。Morsczeck[8]等 用地塞米松和胰島素誘導(dǎo)牙囊細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞分化，骨鈣蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，以上研究結(jié)果表明牙囊細(xì)胞具有一定的成骨特性。

TNF-α是一種炎癥介質(zhì)，在體內(nèi)有多種生物學(xué)活性，包括誘生其它細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞性能，誘導(dǎo)抗病毒活性、血管生成和成纖維細(xì)胞生長等，近年來，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α能促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化，促進(jìn)骨吸收[9]。在前面的文獻(xiàn)回顧中我們提到TNF-α可抑制多種成骨因子的表達(dá)以及促進(jìn)破骨因子的形成，ALP活性就是TNF-α抑制的因子之一。Nakase[10]等研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可抑制成骨細(xì)胞中ALP的表達(dá)，并降低BMP-2、BMP-4引起的ALP的升高。Okabe[11]等研究發(fā)現(xiàn)TNF-α可降低牙髓細(xì)胞的ALP活性，并且這一作用通過NF- κB 和 Smad7信號途徑進(jìn)行的，這一過程可減少繼發(fā)性牙本質(zhì)的形成。本研究中TNF-α在大于10ng/ml時(shí)即可抑制ALP的活性(P<0.05)，說明TNF-α能抑制牙囊細(xì)胞的成骨特性，同時(shí)也說明牙囊細(xì)胞具有成骨和破骨兩種特性，在不同因子的作用下，牙囊細(xì)胞可表現(xiàn)不同的特性，也表明在牙齒萌出、發(fā)育過程中，成骨和破骨的發(fā)生是由多種因子共同作用發(fā)生的，可能引起牙胚冠方的骨質(zhì)吸收，根方的骨質(zhì)增生。其時(shí)間、空間的分布是非常復(fù)雜的，也是我們需要進(jìn)一步研究的方向。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的TNF-α作用于體外培養(yǎng)的HDFCs，在濃度為10－50ng/ml可促進(jìn)HDFCs的增殖，10ng/ml的TNF-α在第3天可促進(jìn)HDFCs的增殖，說明TNF-α對HDFCs的促增殖作用存在最佳濃度和最佳時(shí)間。ALP活性的檢測證明：TNF-α濃度>10ng/ml可降低ALP活性。

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[收稿日期]2011-08-13 [修回日期]2011-10-26

編輯/張惠娟