鄧守恒 柯賢柱 楊敬寧 李芳 喻雄杰 陳萍

[摘要]目的：研究硒化殼聚糖軟膏促淺Ⅱ度燙傷小鼠創(chuàng)面愈合的作用。方法：147只昆明種小鼠隨機(jī)分為硒化殼聚糖軟膏治療組、基質(zhì)治療組和京萬(wàn)紅治療組，每組49只，采用將脫毛區(qū)置于70℃恒溫水浴中6s的方法制成10%體表面積淺Ⅱ度燙傷模型，傷情經(jīng)病理切片證實(shí)。各組創(chuàng)面分別用硒化殼聚糖軟膏紗布（1ml/cm2）、基質(zhì)紗布（1ml/cm2）、京萬(wàn)紅紗布（1ml/cm2）覆蓋包扎固定后放回籠中飼養(yǎng)，換藥1次/天，觀察愈合時(shí)間，于傷后12h，第1、3、5、7和9天，分別處死各組小鼠7只，檢測(cè)含水量、羥脯氨酸、TNF、NO、ALT，另取7只做為正常對(duì)照。結(jié)果：①創(chuàng)面愈合時(shí)間：硒化殼聚糖軟膏組為（12.9±2.9）天、基質(zhì)組為（16.3±2.1）天、京萬(wàn)紅組為（11.8±2.4）天，硒化殼聚糖軟膏組比基質(zhì)組明顯縮短（P<0.05）；②創(chuàng)面含水量：傷后第1、3、5天硒化殼聚糖軟膏組[（86.3±3.5）%、（77.8±3.9）%、（72.3±2.7）%]創(chuàng)面含水量顯著低于基質(zhì)組[(92.8±3.2)%、（84.9±4.2）%、（77.2±2.8）%，（P<0.05）]，傷后7～9天，各組均基本恢復(fù)到正常水平；③創(chuàng)面TNF-α水平：傷后12h至1天達(dá)高峰，隨后逐漸下降，至傷后第5天仍高于正常對(duì)照組（P<0.05）；傷后12h、1天、3天、5天，硒化殼聚糖軟膏組和京萬(wàn)紅組TNF水平明顯低于基質(zhì)組（P<0.05）；④創(chuàng)面組織NO含量：傷后12h各燙傷組NO含量達(dá)高峰，隨后下降，至傷后第9天仍高于正常對(duì)照組（P<0.05）；傷后12h、1天，硒化殼聚糖軟膏組和京萬(wàn)紅組NO含量明顯低于基質(zhì)組（P<0.05）；⑤創(chuàng)面羥脯氨酸含量：傷后5、7、9天硒化殼聚糖軟膏組羥脯氨酸含量顯著高于基質(zhì)組和京萬(wàn)紅組（P<0.05）。結(jié)論：硒化殼聚糖軟膏能有效減少燙傷后早期創(chuàng)面組織NO和TNF-α釋放，減少滲出和水腫，晚期通過(guò)增強(qiáng)創(chuàng)面膠原合成來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

[關(guān)鍵詞]硒化殼聚糖軟膏；淺Ⅱ度燙傷；羥脯氨酸；腫瘤壞死因子；一氧化氮

[中圖分類(lèi)號(hào)]R644R332[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）01-0055-02

Effect of Selenium chitosan on wound healing in vivo

DENG Shou-heng1,KE Xian-zhu2,YANG Jing-ning3,LI Fang1,YU Xiong-jie1,CHEN Ping1

(1.Center of Oncology,People's Hospital,Hubei University of Medicine; 2.Department of Orthopedics, People'sHospital,Hubei University of Medicine; 3.Department of Immunology,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,Hubei,China)

Abstract: ObjectiveTo investigate the effects of Selenium chitosan cream on wound healing of superficial second degree burn in rats.MethodsA total of147Kunming rats were randomly and equally divided into Selenium chitosan cream group 、ground substance group and JingWanHong group. Superficial second degree burn covering 10% of total body surface area was produced by immersing in 70℃ water for 6 second. The wounds were respectively covered with Selenium chitosan cream(1ml/cm2),ground substance(1ml/cm2),and JingWanHong(1ml/cm2). The rats were caged separately,and the dressings were changed once daily. The rats wound healing time were observed in all the groups.7 rats in each group were killed and the biopsies of wound tissues were taken on 12 hours and days1,3,5,7,9 after burn for the determination of water contents、hydroxyproline,NO,TNF,blood ALT and Crea .Another 7 rats were selected as control.Results①The time of wound healing was （12.9±2.9）days in Selenium chitosan cream group, （16.3±2.1）days in ground substance group,and （11.8±2.4）days in JingWanHong group respectively. The time for wound healing in Selenium chitosan cream group was significantly shorter than that in ground substance group（P<0.05）. ②The water content in the wound tissue in Selenium chitosan cream group on days 1,3,5 after burn[（86.3±3.5）%、（77.8±3.9）%、（72.3±2.7）%]was lower than those in ground substance group[(92.8±3.2)%、（84.9±4.2）%、（77.2±2.8）%，（P<0.05）]. During 7-9 days after burn, all of them returned to the normal level. ③The TNF-αlevel in wound tissue in each group reached the peak at 12-24h after burn,decreased thereafter, but it was still obviuosly higher than that of normal controls on 5 days after burn（P<0.05）. The TNF-α level in wound tissue in Selenium chitosan cream group and JingWanHong group were markly lower than those in ground substance group at 12h and 1、3、5d after burn（P<0.05）.④The NO content in wound tissue in each group reached the peak at 12h after burn,decreased thereafter, but it was still obviuosly higher than that of normal controls on 9 days after burn（P<0.05）. The NO content in wound tissue in Selenium chitosan cream group and JingWanHong group were markly lower than those in ground substance group at 12h and 1d after burn（P<0.05）. ⑤The hydroxyproline content in the wound tissue in Selenium chitosan cream group on days 5,7,9 after burn was higher than that in ground substance group（P<0.05）and in JingWanHong group（P<0.05）. Conclusion Selenium chitosan cream can accelerate wound healing by decreasing wound tissue NO and TNF-α release、enhancing collagen synthesis and lessening permeability and edema.

Key words: selenium chitosan cream; superficial second degree burn; hydroxyproline; TNF-α; NO

硒化殼聚糖[1]是將殼聚糖與亞硒酸在酸性條件下，以混合金屬離子為催化劑，通過(guò)拼合原理制備而成的有機(jī)硒，前期研究結(jié)果顯示，硒化殼聚糖可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的人皮膚成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞增殖，且無(wú)明顯毒副作用[2-3]，這為進(jìn)一步將硒化殼聚糖開(kāi)發(fā)成促創(chuàng)傷愈合藥奠定了基礎(chǔ)。硒化殼聚糖軟膏是以硒化殼聚糖為主制備而成的軟膏劑[4]，為評(píng)價(jià)其體內(nèi)作用效果，筆者在小鼠身上復(fù)制淺Ⅱ度燙傷模型，觀察了硒化殼聚糖軟膏用于治療燙傷的療效并探討了可能的作用機(jī)制。

1材料和方法

1.1 藥品試劑與儀器：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、L－羥脯氨酸試劑盒、一氧化氮（NO）、血肌酐（Crea）、腫瘤壞死因子（TNF）試劑盒（南京建成生物工程公司）；京萬(wàn)紅軟膏（天津達(dá)仁堂制藥二廠，批號(hào)211556）；UV-Vis 9200分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（國(guó)華電器公司）；Medal680酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio－Rad公司）；昆明種3月齡小鼠，我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK（鄂）2006-2009。

1.2方法

1.2.1硒化殼聚糖軟膏制備：參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。

1.2.2動(dòng)物模型制作[5]：參照文獻(xiàn)[5]方法將小鼠背部用8%的Na2S水溶液脫毛，脫毛后適應(yīng)1天，禁食，乙醚麻醉，脫毛區(qū)放入70℃恒溫水浴中6s，制備10%淺Ⅱ度燙傷模型。造模成功以肉眼可見(jiàn)創(chuàng)緣環(huán)繞一白色邊界線，與創(chuàng)面周?chē)Ｆつw形成明顯的分界，病理切片見(jiàn)真皮乳頭層有明顯充血、水腫和白細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維腫脹、離散。將燙傷小鼠隨機(jī)分為3組，即硒化殼聚糖軟膏組（A）、不含硒化殼聚糖固體分散劑和冰片的空白基質(zhì)組（B）、京萬(wàn)紅組（C），每組49只，另取7只小鼠不燙傷，作為正常對(duì)照組。

1.2.3給藥方法：各組小鼠分別外用硒化殼聚糖軟膏紗布（1ml/cm2）、基質(zhì)紗布（1ml/cm2）、京萬(wàn)紅紗布（1ml/cm2）覆蓋，包扎固定后分籠飼養(yǎng)，每日換藥一次。

1.2.4檢測(cè)指標(biāo)：在傷后12h，第1、3、5、7和9天，分別處死各組小鼠7只，取標(biāo)本檢測(cè)創(chuàng)面含水量、創(chuàng)面羥脯氨酸含量、創(chuàng)面組織TNF-α水平、NO含量和ALT活性，每組中所剩7只用于觀測(cè)創(chuàng)面愈合時(shí)間，即創(chuàng)面瘢痕完全脫落所需時(shí)間。創(chuàng)面含水量測(cè)定[6]：處死小鼠后，取創(chuàng)面組織約1g，稱(chēng)重，放入80℃烤箱中，烘烤72h后稱(chēng)重，組織含水量＝（濕重－干重）/濕重×100%。羥脯氨酸含量測(cè)定參見(jiàn)文獻(xiàn)[7]方法。TNF-α、NO、ALT按試劑盒說(shuō)明檢測(cè)。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所獲數(shù)據(jù)均以x±s表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，組間、組內(nèi)比較采用ANOVA分析。

2結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間A組小鼠創(chuàng)面愈合平均時(shí)間為(12.9±2.9)天，與B組平均時(shí)間16.3±2.1天明顯減少，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,與C組11.8±2.4天比較無(wú)差異（P>0.05）。

2.2 創(chuàng)面組織含水量各組小鼠燙傷后創(chuàng)面組織含水量均較空白對(duì)照組顯著增高，傷后12h達(dá)到高峰，其后開(kāi)始下降。傷后第1、3、5天A組的小鼠創(chuàng)面含水量顯著低于B組（P<0.05），與C組比較無(wú)顯著差別（P>0.05），第7天以后各組小鼠創(chuàng)面含水量則沒(méi)有顯著差異,見(jiàn)表1。

2.3創(chuàng)面組織TNF-α水平各組燙傷后小鼠創(chuàng)面組織TNF-α水平均高于燙傷前的正常水平（P<0.05），傷后12h至1天達(dá)高峰，隨后逐漸下降，至傷后第5天仍高于燙傷前正常對(duì)照組（P<0.05），傷后第7天各組TNF水平基本恢復(fù)至正常。燙傷后12h、1天、3天、5天，A組和C組與B組比較，創(chuàng)面組織中TNF水平減少（P<0.05）；A組和C組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表2。

2.4 NO含量各燙傷組小鼠創(chuàng)面組織NO含量均高于燙傷前正常對(duì)照組（P<0.05,P<0.01），傷后12h達(dá)高峰，隨后下降，至傷后第9天仍高于正常對(duì)照組（P<0.05）。傷后12h、1天，B組創(chuàng)面組織NO含量明顯高于A組和C組（P<0.05），A組和C組創(chuàng)面組織NO含量各時(shí)相點(diǎn)比較均無(wú)顯著差異（P>0.05），見(jiàn)表3。

2.5創(chuàng)面羥脯氨酸含量燙傷后小鼠創(chuàng)面羥脯氨酸含量進(jìn)行性增加，但從燙傷后第3天起，A組小鼠羥脯氨酸含量增加速度明顯加快，各對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)羥脯氨酸含量均顯著高于B組和C組（P<0.05）,見(jiàn)表4。

2.6谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平 各組小鼠各時(shí)相點(diǎn)血中ALT活性與燙傷前相比較無(wú)顯著性差異（P>0.05），傷后各時(shí)相點(diǎn)A組ALT水平與B組和C組比較亦無(wú)顯著性差異（P>0.05）,見(jiàn)表5。

3討論

燒燙傷是臨床常見(jiàn)損傷，小面積燒燙傷主要采用藥物涂敷暴露或半暴露治療，由于臨床所用的促創(chuàng)面愈合外用藥多為膏劑，故將硒化殼聚糖加工成膏劑來(lái)評(píng)估其藥效較為合適。本研究以京萬(wàn)紅為陽(yáng)性對(duì)照，以制作硒化殼聚糖軟膏所用的基質(zhì)為對(duì)照，觀察硒化殼聚糖軟膏對(duì)淺Ⅱ度燙傷小鼠創(chuàng)面愈合的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外用硒化殼聚糖軟膏后，燙傷小鼠創(chuàng)面愈合平均時(shí)間比基質(zhì)組明顯縮短，創(chuàng)面水腫消退時(shí)間也快于基質(zhì)組，說(shuō)明硒化殼聚糖軟膏確實(shí)具有促創(chuàng)面愈合的作用。

已知炎癥反應(yīng)全程參與了創(chuàng)面的損傷和修復(fù)，燒傷后創(chuàng)面組織細(xì)胞和炎癥細(xì)胞大量釋放炎癥因子引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，并同時(shí)啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)，使細(xì)胞進(jìn)入增殖修復(fù)狀態(tài)， TNF是參與炎癥反應(yīng)的主要炎癥因子之一[8]。本研究表明，燙傷后小鼠創(chuàng)面組織TNF顯著增加，但硒化殼聚糖軟膏組在各時(shí)相點(diǎn)尤其是在燙傷后3天內(nèi)，均能顯著減少TNF的釋放，表明硒化殼聚糖軟膏可有效抑制創(chuàng)面組織中TNF等炎癥因子的過(guò)度合成和釋放，降低炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，減輕過(guò)度炎癥反應(yīng)對(duì)創(chuàng)面的損傷。

組織損傷可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，高濃度NO作為一種前炎性細(xì)胞因子，能和超氧陰離子等反應(yīng)，引發(fā)體內(nèi)自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，還能促進(jìn)炎癥局部多種細(xì)胞因子合成，從而引發(fā)瀑布式的炎性反應(yīng)，直接和間接損傷組織細(xì)胞[9]。本研究顯示，燙傷可使小鼠創(chuàng)面組織NO含量顯著增加并持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，而硒化殼聚糖軟膏則能顯著減少NO含量，從而從源頭上減輕或抑制了炎性反應(yīng)的發(fā)生。

膠原合成是創(chuàng)面愈合過(guò)程的重要環(huán)節(jié)，由于羥脯氨酸所占膠原的比例相對(duì)恒定，故測(cè)定羥脯氨酸的含量便可反映膠原的水平。本實(shí)驗(yàn)中各組小鼠創(chuàng)面羥脯氨酸的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)均有增加，但第三天開(kāi)始硒化殼聚糖軟膏組羥脯氨酸的含量就顯著高于基質(zhì)組和京萬(wàn)紅組，說(shuō)明硒化殼聚糖軟膏有促進(jìn)創(chuàng)面膠原合成的作用。

以上研究表明硒化殼聚糖軟膏在燙傷后早期能通過(guò)減少創(chuàng)面組織TNF和NO的合成和釋放，減輕炎性反應(yīng)，阻止創(chuàng)面進(jìn)一步加深和壞死對(duì)創(chuàng)面產(chǎn)生保護(hù)，后期則通過(guò)增強(qiáng)膠原合成來(lái)促進(jìn)創(chuàng)面愈合，而對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的檢測(cè)結(jié)果顯示硒化殼聚糖軟膏未對(duì)小鼠的肝功能產(chǎn)生明顯損傷，說(shuō)明硒化殼聚糖軟膏確實(shí)是一種值得開(kāi)發(fā)的治療燙傷外用藥。

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[收稿日期]2011-08-08 [修回日期]2011-10-16

編輯/張惠娟