吳福勇 畢銀麗 毛艷麗

摘要：采用室內(nèi)試驗的方法研究不同接種方式接種威廉環(huán)毛蚓（Pheretima guillelmi）、植物促生根際細菌（鉀活化細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）和固氮細菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５））對土壤中固氮細菌和鉀活化細菌的生長、土壤脲酶的活性以及土壤鉀有效性的影響。７種接種方式均明顯增加了土壤中固氮細菌和鉀活化細菌的生長。蚯蚓活動對土壤中固氮細菌生長的影響有限，但明顯增加了鉀活化細菌的生長。接種蚯蚓、接種固氮細菌、接種蚯蚓和固氮細菌均明顯增加了土壤中脲酶的活性。土壤中脲酶活性和速效鉀的濃度分別與土壤中固氮細菌與鉀活化細菌的數(shù)量成顯著正相關關系（Ｐ＜０．０５）。試驗結果表明，混合接種方式是一種有潛力的生物技術，可以用來減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥的施用量。

關鍵詞：蚯蚓；植物促生根際細菌；混合接種；土壤酶活性

中圖分類號：Ｑ９３９．１ 文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）15－3186-04

Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ Ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ ｏｎ Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ

ｏｆ Ｎ ａｎｄ Ｋ ｉｎ Ｓｏｉｌ

ＷＵ Ｆｕ－ｙｏｎｇ１，２，ＢＩ Ｙｉｎ－ｌｉ２，ＭＡＯ Ｙａｎ－ｌｉ１

（１． Department of Environmental arol Municipal Engineering， Ｈｅｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｒｂａｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ， Ｐｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ ４６７０３６２， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｃｈｉｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ ｐｏｔ ｔｒｉａｌ ｗａｓ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ， ｄｕａｌ ｏｒ ｔｒｉｐｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ ｏｒ ｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｒｈｉｚｏｂａｃｔｅｒｉａ （ＰＧＰＲ）， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｎｉｔｒｏｇｅｎ－ｆｉｘｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ （ＮＦＢ） （Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５） ａｎｄ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ－ｓｏｌｕｂｉｌｉｚｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ （ＫＳＢ）（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）， ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ＫＳＢ ａｎｄ Ｎ ａｎｄ Ｋ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｓｏｉｌｓ． Ａｌｌ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｖｅｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ＫＳＢ． Ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ｈａｄ ｌｉｍｉｔｅｄ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＮＦＢ， ｂｕｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ＫＳＢ． Ｔｈｒｅｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ， ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ｄｕａｌ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｔｈｗｏｒｍ ａｎｄ ＮＦＢ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｕｒｅａｓｅ ｉｎ ｓｏｉｌｓ obviously． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｒｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ＮＦＢ ａｎｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＨ４ＯＡｃ－ｅｘｔｒａｃｔａｂｌｅ Ｋ （ｒ=０．４７， Ｐ＜０．０５） ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ＫＳＢ （ｒ＝０．４４， Ｐ＜０．０５） ｉｎ ｓｏｉｌ． Ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｍａｙ ｂｅ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｆｅｒｔｉｌｉｚｅｒｓ ｉｎ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅａｒｔｈｗｏｒｍｓ； ＰＧＰＲ； ｍｉｘｔｕｒｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ； ｓｏｉｌ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ

蚯蚓普遍存在于溫帶和熱帶生態(tài)系統(tǒng)中，是重要的陸地生態(tài)系統(tǒng)工程師［１］。蚯蚓在促進有機物質(zhì)分解和礦質(zhì)營養(yǎng)元素循環(huán)、轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮著十分重要的作用。據(jù)估計，通過排泄及分泌黏液，蚯蚓大約每年向每平方米土壤提供３．４～４．１ ｇ的礦化氮［２］。此外，土壤中廣泛存在的植物促生根際細菌（包括固氮細菌和鉀活化細菌）也能夠明顯增加土壤營養(yǎng)元素的可利用性，進而促進植物的生長［３，４］。蚯蚓可以通過直接取食、攜帶傳播微生物等方式影響土壤微生物群落的數(shù)量、活性、組成和功能，因此，蚯蚓與微生物交互作用是土壤生態(tài)學研究的一個重點。Ｐａｒｌｅ［５］研究表明，土壤通過蚯蚓腸道后，細菌、放線菌的數(shù)目有大幅度的增加，而真菌的數(shù)目無變化。然而，蚯蚓活動對土壤中固氮細菌和鉀活化細菌生長的影響目前尚不清楚。

土壤中營養(yǎng)元素的濃度通常受土壤中有關酶活性的影響。土壤微生物和植物的根均能夠產(chǎn)生該類酶。當土壤中可利用的營養(yǎng)元素降低時，土壤微生物或植物均能夠增加這些酶的分泌，從而促進無機氮和磷的供應。土壤脲酶普遍存在于土壤中，是由細菌分泌的一種酶，并在氮素轉(zhuǎn)化時發(fā)揮關鍵作用，能分解有機氮化合物，為植物提供氮素營養(yǎng)［６］。徐曉燕等［７］研究表明，蚯蚓活動能夠增加農(nóng)田土壤中脲酶的活性。然而，同時接種蚯蚓與植物促生根際細菌對土壤中脲酶的活性及營養(yǎng)元素可利用性的影響尚不清楚。本研究通過室內(nèi)盆栽試驗了解蚯蚓活動對土壤中固氮細菌和鉀活化細菌生長的影響，研究接種蚯蚓、固氮細菌、鉀活化細菌分別對土壤脲酶的活性影響以及對土壤中鉀有效性的影響，研究結果將為增加土壤肥力，減少農(nóng)田化肥施用量、改善農(nóng)田環(huán)境奠定一定的理論基礎。

１材料與方法

１．１材料

試驗用蚯蚓為威廉環(huán)毛蚓（Ｐｈｅｒｅｔｉｍａ ｇｕｉｌｌｅｌｍｉ）采集于河南平頂山郊區(qū)菜田，并在室內(nèi)培養(yǎng)３周。室內(nèi)盆栽試驗前，為最大程度減少蚯蚓體表及消化道內(nèi)細菌對試驗的影響，蚯蚓放置在滅菌玻璃瓶（直徑１２ ｃｍ、高１４ ｃｍ）內(nèi)餓食２４ ｈ。所有供試蚯蚓為成年蚯蚓，鮮體重約為１．５ ｇ。試驗用固氮細菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ ＰＤＳＮ－５）及鉀活化細菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｕｃｉｌａｇｉｎｏｕｓ ＰＤＳＫ－１）均采集于河南平頂山郊區(qū)菜田，分離及培養(yǎng)按照參考文獻［８］的方法進行。培養(yǎng)后的２種細菌分別轉(zhuǎn)移至經(jīng)高溫高壓蒸汽滅菌（１２１ ℃， ２０ ｍｉｎ）的草炭（直徑２ ｍｍ），４ °Ｃ保存待用。該混合物將做為微生物接種劑，草炭中的固氮細菌及鉀活化細菌種群密度分別為５．０×１０９ 和 ４．０×１０９ ＣＦＵ／ｋｇ （干重）。 供試土壤采集于河南平頂山郊區(qū)菜田（０～１０ ｃｍ表層土），理化性狀如表１所示。土壤在裝盆前過篩（直徑＜２ ｍｍ）、高溫高壓蒸汽滅菌（１２１℃， ２ ｈ）， 風干備用。

１．２方法

１．２．１試驗設計室內(nèi)試驗采用如下８種處理：接種蚯蚓、接種固氮細菌、接種鉀活化細菌、接種蚯蚓＋鉀活化細菌、接種鉀活化細菌＋固氮細菌、接種蚯蚓＋鉀活化細菌＋固氮細菌以及對照處理（不接種蚯蚓及植物促生根際細菌），每處理設３個重復。

１．２．２接種方法每盆（１２ ｃｍ×１３ ｃｍ，高×直徑）裝風干土壤１．５ ｋｇ，每盆添加３個大小基本一致的蚯蚓作為接種蚯蚓處理，為防止蚯蚓逃逸，土層表面覆蓋塑料膜。每盆接種植物促生根際細菌（備用草炭）５ ｇ，對照及接種蚯蚓處理組分別加入相應的５ ｇ滅菌菌劑和２５ ｍＬ菌劑濾液，以保持土壤中除植物促生根際細菌外其他微生物區(qū)系的一致性。

１．２．３試驗管理試驗于日光溫室（２８ ℃（晝）／２３ ℃（夜））中進行，每３天澆１次去離子水，維持土壤含水量在最大持水量的６０％。３０ ｄ后每盆隨機采集５０ ｇ土壤樣品， 一半新鮮土樣用來測定土壤脲酶、活體固氮細菌和鉀活化細菌，一半風干待用。

１．２．４樣品分析土壤中Ｎ、Ｐ、Ｋ含量采用常規(guī)方法測定。液土比５∶１測定土壤ｐＨ、ＥＣ，試驗用水為無ＣＯ２去離子水。按照參考文獻［９］的方法測定土壤中活體固氮細菌和活體鉀活化細菌的菌落形成單位。土壤脲酶活性測試采用靛酚比色法［１０］，以尿素為反應基質(zhì)，經(jīng)土壤脲酶酶促水解反應后生成氨，氨與酚類化合物起反應生成藍色的靛酚，顏色深度與氨含量相關。脲酶活性以１ ｇ 土壤在３７ ℃下培養(yǎng)２ ｈ釋放出ＮＨ３－Ｎ的微克數(shù)表示。

１．２．５統(tǒng)計分析對數(shù)據(jù)結果采用ＳＡＳ ８．１軟件利用最小顯著法進行方差分析，所有處理均在０．０５水平下進行顯著性分析。

２結果與分析

２．１接種蚯蚓及植物促生根際細菌對土壤中固氮細菌和鉀活化細菌生長的影響

接種蚯蚓及植物促生根際細菌明顯增加了土壤中固氮細菌和鉀活化細菌的生長（圖１）。接種蚯蚓、接種固氮細菌、接種蚯蚓＋固氮細菌、接種固氮細菌＋鉀活化細菌和混合接種的土壤中固氮細菌的數(shù)量分別為對照的５．４、２０．７、１５．２、１９．３、１６．５倍（圖１ａ）。接種蚯蚓＋固氮細菌處理與接種蚯蚓、接種固氮細菌處理相比，土壤中固氮細菌數(shù)量均無統(tǒng)計學差異?；旌辖臃N處理與接種固氮細菌＋鉀活化細菌處理相比，土壤中固氮細菌數(shù)量也無統(tǒng)計學差異，這說明蚯蚓活動對土壤中固氮細菌生長的影響有限。另外，接種蚯蚓、接種鉀活化細菌、接種蚯蚓＋鉀活化細菌、接種固氮細菌＋鉀活化細菌、混合接種的土壤中鉀活化細菌的數(shù)量分別為對照的５．０、９．７、１２．１、８．５、１８．３倍（圖１ｂ）?；旌辖臃N處理下土壤中鉀活化細菌數(shù)量顯著多于接種鉀活化細菌＋固氮細菌處理（Ｐ＜０．０５），接種蚯蚓＋鉀活化細菌處理分別與接種蚯蚓及接種鉀活化細菌處理相比土壤中鉀活化細菌數(shù)量也有增加的趨勢，表明蚯蚓活動明顯增加了土壤中鉀活化細菌的生長。

２．２接種蚯蚓及植物促生根際細菌對土壤中脲酶活性和速效鉀濃度的影響

接種蚯蚓及植物促生根際細菌對土壤中脲酶活性和速效鉀濃度的影響見圖２。接種蚯蚓、接種固氮細菌、接種蚯蚓＋固氮細菌均明顯增加了土壤中脲酶的活性，其中后兩種接種方式與對照相比較，差異均達到顯著水平（Ｐ＜０．０５）。接種蚯蚓對土壤中速效鉀濃度的影響不大，但是，接種鉀活化細菌及接種蚯蚓＋鉀活化細菌明顯增加了土壤中速效鉀濃度。接種蚯蚓＋鉀活化細菌處理中速效鉀濃度是對照的２．１倍，與對照相比達到統(tǒng)計學顯著水平（Ｐ＜ ０．０５）。此外，土壤中脲酶活性和速效鉀的濃度分別與土壤中固氮細菌與鉀活化細菌成顯著正相關關系（ｒ＝０．４７，Ｐ＜０．０５；ｒ＝０．４４，Ｐ＜０．０５）（表２）。

３討論

蚯蚓和微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，它們的存在提高了土壤容納和供給生物所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)的能力［１１］。蚯蚓活動能夠影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中其他微生物的生長。本試驗結果表明，蚯蚓對土壤中固氮細菌的生長影響不大，但對鉀活化細菌生長具有明顯促進作用。徐曉燕等［１２］的研究結果顯示：無論是接種人工培養(yǎng)的蚯蚓或是接種野生的蚯蚓，均會導致土壤中微生物類群的數(shù)量有不同程度的增加，其中細菌數(shù)量的增加比放線菌和真菌的增加明顯。Ｚｈａｎｇ等［１３］研究表明，經(jīng)蚯蚓過腹轉(zhuǎn)化的土壤更有利于微生物的生長繁殖，從而進一步增加微生物數(shù)量與活性。蚯蚓活動對鉀活化細菌的促生作用機理需更深入更系統(tǒng)的研究。此外，單接種蚯蚓處理土壤中的固氮細菌及鉀活化細菌可能來自于蚯蚓自身肛腸內(nèi)。

接種蚯蚓、固氮細菌和鉀活化細菌顯著增加了根際土壤中脲酶的活性及速效鉀的濃度。土壤酶活性與土壤微生物活動有很強的相關性［１４］。本試驗結果表明，土壤中脲酶的活性與土壤中的固氮細菌的數(shù)量呈顯著正相關關系。此外，蚯蚓也可以通過排糞、作穴、攪動等活動來改善土壤的營養(yǎng)狀況。徐曉燕等［７］研究表明，當接種毛利環(huán)毛蚓的數(shù)量增加１倍后，土壤脲酶活性增加了５９．３％。劉賓等［１５］認為在紅壤中接種蚯蚓可以顯著提高土壤中銨態(tài)氮的含量。與對照相比，接種蚯蚓＋鉀活化細菌造成鉀活化細菌顯著增加，從而造成土壤中速效鉀濃度的顯著升高。鉀活化細菌能夠產(chǎn)生有機酸，這些有機酸能夠改變硅酸鹽的組成結構，進而向土壤中釋放可利用態(tài)鉀。Ｆａｌｌａｈ等［１６］研究表明，鉀活化細菌存在時，可以導致土壤中多釋放出１６％～４０％的可利用態(tài)鉀。綜上所述，本研究結果表明，混合接種方式是一種有潛力的生物技術，可以用來減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的化肥施用量，特別是對大范圍的依賴有機物分解釋放養(yǎng)分的有機農(nóng)業(yè)尤為重要。

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