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        鴿蛔蟲ITS rDNA的克隆與序列分析

        2012-04-29 11:37:33李金平張浩吉梁詳解蒲文珺李高強郭建超李國清
        湖北農業(yè)科學 2012年18期
        關鍵詞:序列分析

        李金平 張浩吉 梁詳解 蒲文珺 李高強 郭建超 李國清

        摘要:以采自廣東省佛山市的鴿蛔蟲(Ascaridia columbae)為研究對象,利用保守引物BD1和BD2擴增鴿蛔蟲基因組DNA的ITS rDNA片段,對擴增產物進行克隆和序列測定。結果成功擴增出大小為1 045 bp的ITS rDNA序列。獲得的鴿蛔蟲的ITS rDNA序列(AC001、AC002)的5.8 S rDNA與GenBank收錄的雞蛔蟲5.8 S rDNA序列(GenBank登錄號為AJ001508)相似性分別為95.5%和94.3%,而與澳大利亞鴿蛔蟲5.8 S rDNA序列(GenBank登錄號為AJ001509)相似性分別為96.8%和95.5%。將獲得的序列與蛔目不同科的代表性蛔蟲的5.8 S rDNA序列進行比對和系統(tǒng)進化分析,結果表明鴿蛔蟲與雞蛔蟲處于同一進化分支上,也表明ITS rDNA是蛔蟲分子鑒定的有效遺傳標記,這對蛔蟲分子分類學及分子流行病學的進一步研究打下了基礎。

        關鍵詞:鴿蛔蟲(Ascaridia columbae);ITS rDNA;序列分析;系統(tǒng)進化分析

        中圖分類號:S852.73+1;Q785文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2012)18-4138-03

        Clone and Sequence Analysis of ITS rDNA of Ascaridia columbae

        LI Jin-ping1,2,ZHANG Hao-ji2,LIANG Xiang-jie1,PU Wen-jun2,LI Gao-qiang1,GUO Jian-chao1,LI Guo-qing1

        (1.College of Veterinary Medicine,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;

        2. Foshan University of Science and Technology, Foshan 528231,Guangdong,China)

        Abstract:The internal transcribed spacer(ITS) rDNA of roundworm(Ascaridia columbae) samples collected from Foshan, Guangdong were amplified by PCR using a pair of conserved primers BD1 and BD2. Then the sequence was cloned, sequenced and analyzed. The results showed that the ITS rDNA sequence of A. columbae was 1 045 bp. The similarity of 5.8 S rDNA sequence of A. columbae (AC001, AC002) to that of A. galli (GenBank Accession number, AJ001508) was 95.5% and 94.3% respectively; and to that of Australian A. columbae (GenBank Accession number, AJ001509) was 96.8% and 95.5% respectively. Alignments and phylogenetic analysis of 5.8S rDNA sequences of A. columbae and representative species in different families of Ascaridida showed that A. galli and A. columbae were in the same evolutionary branch. It was proved that ITS rDNA was effective genetic marker of Ascaridida, which layed the foundation for molecular taxonomic and epidemiological research of Ascaridida.

        Key words:Ascaridia columbae; ITS rDNA; sequence analysis; phylogenetic analysis

        鴿蛔蟲(Ascaridia columbae)是禽蛔科禽蛔屬的一種大型線蟲,主要寄生于鴿、孔雀等的小腸,具有較廣泛的地理分布。鴿感染了鴿蛔蟲后的主要癥狀表現為食欲不振、精神沉郁、下痢、消瘦、貧血,直至衰竭死亡。幼鴿易感,成鴿感染后會導致消瘦、飛行力下降,對養(yǎng)鴿業(yè)的危害很大。

        傳統(tǒng)的蛔蟲鑒定方法是依據蟲體進行形態(tài)學鑒定,此法簡單易行,鑒定成蟲比較準確,但對于蛔蟲的蟲卵和幼蟲,形態(tài)學鑒定往往具有局限性。近些年來,隨著現代分子生物學技術的不斷發(fā)展,將PCR擴增和序列分析技術相結合,可以從基因水平揭示物種間的差異和系統(tǒng)發(fā)生關系[1]。在開展寄生蟲的分子鑒定和分子分類學研究中,選擇適當的遺傳標記至關重要。ITS是rDNA中介于18 S和28 S之間的內轉錄間隔區(qū),包括ITS1、5.8 S rDNA和ITS2,進化速度快且長度不大,加上協(xié)同進化使該片段在基因組不同單元間十分一致,種內具有高度保守性,在不同種間又有不同程度的變異,是理想的種間鑒定的遺傳標記,這對于寄生蟲的分子分類學、分子遺傳學、種(株)鑒定等方面的研究有重要意義[2,3]。

        目前,尚未見到有關鴿蛔蟲鑒定的報道。為此,本試驗通過對鴿蛔蟲樣品的DNA提取,ITS rDNA克隆及序列分析,旨在鑒定出鴿蛔蟲的種類,為進一步的分子遺傳學和分子診斷學研究以及鴿蛔蟲病的防治打下基礎。

        1材料與方法

        1.1材料

        鴿蛔蟲采自廣東省佛山市某鴿場,置于體積分數為70%的乙醇中保存,Ex Taq DNA聚合酶、EcoRⅠ、T4 DNA連接酶和pMD18-T載體均購自寶生物工程(大連)有限公司,蛋白酶K購自德國默克醫(yī)藥公司,UNIQ-10柱式PCR產物純化試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司,DNA抽提試劑盒WizardTM DNA Clean-Up System購自Promega公司,大腸桿菌DH5α為華南農業(yè)大學獸醫(yī)寄生蟲學實驗室保存。

        1.2方法

        1.2.1鴿蛔蟲總DNA的提取取單個鴿蛔蟲成蟲的一小段于1.5 mL離心管中,剪碎并研磨,然后加入275 μL的SDS DNA裂解液,混勻后放入微量恒溫器中,于55 ℃作用16~18 h,每隔1~2 h振蕩1次。消化完全后,根據WizardTM DNA Clean-Up System使用說明,對蟲體懸液進行提取。

        1.2.2引物的選擇與合成參照文獻[4-7]選擇能擴增大部分線蟲ITS rDNA基因的BD1和BD2分別作為上游和下游引物,其中BD1序列為5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3′,BD2序列為5′-ATGCTTAAATTCAGCGGGT-3′。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,預期擴增片段大小約1 000 bp。

        1.2.3ITS rDNA的PCR擴增向0.2 mL Eppendorf管中依次加入10×Buffer(不含Mg2+)2.5 μL、8.0 mmol/L dNTPs 2.0 μL、25 mmol/L MgCl2 2.0 μL、25 pmol/μL BD1 0.5 μL、25 pmol/μL BD2 0.5 μL,5 U/μL Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL、模板DNA 2.0 μL,最后補去離子水使PCR反應體系的總體積為25 μL。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃、30 s,55 ℃、30 s,72 ℃、1 min,37個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

        1.2.4ITS rDNA的克隆用UNIQ-10柱式PCR產物純化試劑盒回收目的片段,將其連接到pMD18-T載體上,將重組質粒轉化感受態(tài)細胞DH5α,涂布于含氨芐青霉素的LB平板上,于37 ℃培養(yǎng)過夜,挑取陽性菌落進行菌液PCR初步鑒定。將陽性菌液送上海博尚生物技術有限公司進行核苷酸序列測定。

        1.2.5序列分析將所測定的序列與GenBank中所收錄的相關序列進行比對。使用DNAstar V5.07的EditSeq和Megalign程序進行序列分析,比較其核苷酸序列相似性和遺傳關系,并在此基礎上建立系統(tǒng)進化分析圖。

        2結果

        2.1鴿蛔蟲ITS rDNA的PCR擴增結果

        將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠進行電泳,可見大小約1 000 bp的條帶(圖1),與預期目的片段大小一致。用純化回收試劑盒回收PCR產物并將之克隆到pMD18-T載體上,轉化至感受態(tài)細胞DH5α,取鴿蛔蟲樣品1、2的白色單菌落進行菌液PCR鑒定,均得到大小約1 000 bp的條帶。

        2.2序列比對結果

        選取鴿蛔蟲樣品1、2的陽性克隆樣品送上海英俊生物技術有限公司測序,測序結果表明這兩份樣品的ITS rDNA序列大小均為1 045 bp。將獲得的序列進行BLAST分析,結果表明,其5.8 S rDNA序列與雞蛔蟲的5.8 S rDNA序列(GenBank登錄號為AJ001508)的相似性分別為95.5%和94.3%,證明此ITS rDNA序列為蛔蟲的。然后利用DNAstar V5.07對2個樣品的ITS rDNA序列進行比對,其同源性為98.7%。

        2.3系統(tǒng)進化分析結果

        用DNAstar V5.07將測序所得的鴿蛔蟲的5.8 S rDNA(AC001、AC002)與GenBank收錄的其他蛔蟲的相應序列進行比較分析,結果見圖2和圖3。

        從圖2和圖3可知,從廣東省佛山市分離的鴿蛔蟲的5.8 S rDNA(AC001、AC002)序列和GenBank中所收錄的澳大利亞鴿蛔蟲、豬蛔蟲、牛新蛔蟲、人蛔蟲、澳大利亞雞蛔蟲、簡單異尖線蟲、犬弓首蛔蟲、貓弓首蛔蟲和獅弓蛔蟲的5.8 S rDNA序列存在著不同程度的差異。其中,從廣東省佛山市分離的鴿蛔蟲的5.8 S rDNA序列(AC001、AC002)與澳大利亞鴿蛔蟲5.8 S rDNA序列(GenBank登錄號為AJ001509)處于并列位置,相似性分別為96.8%和95.5%,而與澳大利亞雞蛔蟲5.8 S rDNA序列(GenBank登錄號為AJ001508)相似性分別為95.5%和94.3%,因此可以說AC001、AC002與AJ001509同源性較高,所以可以推斷鴿蛔蟲的5.8 S rDNA序列非常保守,但還是存在著國家或地區(qū)上的地理差異。

        3討論

        隨著生物種群的不斷進化和發(fā)展,寄生蟲的形態(tài)學鑒定越來越顯出它的局限性,尤其對那些相似種或近緣種來說,從形態(tài)上很難進行區(qū)分,這時就需要采用其他方法來對寄生蟲進行分類和鑒定。隨著分子生物學技術的發(fā)展,采用PCR方法對寄生蟲某段具有種特異性的DNA進行序列分析成為寄生蟲分類和鑒定的必要手段。ITS是rDNA中介于18 S和28 S之間的內轉錄間隔區(qū),包括ITS1和ITS2兩段序列,在種內具有高度保守性,在不同種間又有不同程度的變異。而在生物進化過程中18 S、5.8 S和28 S rDNA具有種內高度保守性,在不同種間又有不同程度的變異,是理想的種間鑒定的遺傳標記[8-11]。以ITS為遺傳標記進行PCR擴增與序列比較已經成功地應用于多種寄生蟲的分子水平的鑒定及分類。

        因此試驗也采用PCR擴增鴿蛔蟲ITS rDNA并進行序列分析,從而對鴿蛔蟲的分子鑒定和分子分類進行研究。由于NCBI數據庫對于鴿蛔蟲的ITS1和ITS2序列暫時還沒有報道,因此本試驗未對ITS1和ITS2序列做進化分析。而將鴿蛔蟲的5.8 S rDNA(AC001、AC002)序列與AJ001509序列進行了比較,結果表明,澳大利亞鴿體內的鴿蛔蟲的5.8 S rDNA序列和廣東省佛山市鴿體內鴿蛔蟲的5.8 S rDNA有較高的同源性(分別為96.8%和95.5%),但還是存在著國家或地區(qū)上的地理差異。該研究為鴿蛔蟲分類、鑒定和遺傳變異的進一步研究打下了基礎。

        參考文獻:

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        (責任編輯田宇曦)

        收稿日期:2011-11-21

        基金項目:廣東省自然科學基金項目(10152800001000007)

        作者簡介:李金平(1984-),女,廣東茂名人,碩士,研究方向為預防獸醫(yī)學,(電話)15889967014(電子信箱)lijinping2007@126.com;

        通訊作者,張浩吉,教授,(電話)13929964869(電子信箱)zhanghaoji@yahoo.com.cn。

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