陳飛 盧火佺 臧發(fā)榮 周雪鋒

[摘要] 目的 探討血清中l(wèi)et—7、miR—125b—1、miR—21水平與非小細胞肺癌（NSCLC）的相關(guān)性。 方法 收集NSCLC患者與健康對照人群的血清，通過熒光定量PCR檢測并比較外周血let—7、miR—125b—1、miR—21的表達水平。 結(jié)果 let—7、miR—125b—1表達量在NSCLC患者血清中均低于對照組，而miR—21表達量顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均為P < 0.01）。其與健康對照組血清的比值平均為21.1%、13.5%、207.4%。 結(jié)論 外周血let—7、miR—125b—1、miR—21水平可能成為一種新的生物標記物用于NSCLC的早期診斷。

[關(guān)鍵詞] 非小細胞肺癌；miRNA；血清；早期診斷

[中圖分類號] R734.2[文獻標識碼] B[文章編號] 1673—9701（2012）25—0056—02

Correlation study on serum levels of three miRNA and early diagnosis of non—small cell lung cancer

CHEN Fei LU Huoquan ZANG Farong ZHOU Xuefeng

Department of Respiratory Medicine， Changxing County Peoples Hospital in Zhejiang Province， Changxing 313100， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation of let—7， miR—125b—1， miR—21 level in the peripheral blood and non—small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Serum of NSCLC patients and healthy control subjects were collected. Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels were detected by fluorescence quantitative PCR and compared. Results Serum let—7， miR—125b—1 levels in NSCLC patients were significantly decreased， while miR—21 expression was significantly increased （both P < 0.01） than that in the healthy controls. The average ratio of let—7， miR—125b—1 and miR—21 level in the patients and the controls were 21.1% 13.5% and 207.4%， respectively. Conclusion Let—7， miR—125b—1 and miR—21 levels in the peripheral blood may be new biomarkers for early diagnosis of NSCLC.

[Key words] Non—small cell lung cancer； miRNA； Serum； Early diagnosis

肺癌的死亡率在很多國家和地區(qū)居首位，其5年存活率多年來無顯著改善，這與缺乏有效的早期診斷與治療手段有關(guān)。miRNA是一種長度為18—24核苷酸的內(nèi)源性小分子RNA，可與靶基因mRNA的3'端互補區(qū)結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達與翻譯，參與細胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡等一系列生命活動。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA還起到原癌基因、抑癌基因的作用，并具有明顯的腫瘤組織特異性與表達穩(wěn)定性[1]。let—7、miR—125b—1、miR—21等與非小細胞肺癌（NSCLC）的關(guān)系密切，在肺癌組織中表達量顯著異常[2，3]，有望成為NSCLC的早期診斷標志物，但其血液中表達水平與NSCLC的關(guān)系尚不明確。本文即探討let—7、miR—125b—1、miR—21在血液中的表達水平與NSCLC發(fā)生的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

56例液氮保存的血清標本來自我院2007年2月～2010年10月收治的非小細胞肺癌患者，其中男43例，女13例，年齡35～71歲，平均53.9歲。患者術(shù)前均未行腫瘤化療。診斷符合WHO非小細胞肺癌診斷標準（1999年第3版）。另取同期無肺部病變健康體檢者血清56例作對照，其中男41例，女15例，年齡22～64歲，平均52.1歲。兩組人群的性別構(gòu)成、平均年齡差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 材料

miRcute miRNA提取分離試劑盒購自天根公司：逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green熒光定量PCR檢測試劑盒購自日本TaKaRa公司。let—7、miR—125b—1、miR—21及表達內(nèi)參miR—22引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA樣本的制備凍存的血清標本快速復溫，取400 μL融解血清按照miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書要求提取，RNA最終用DEPC水溶解，紫外分光光度計檢測提取的RNA純度，OD260/OD280比值>1.8。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄以逆轉(zhuǎn)錄PCR反應擴增目標基因，采用20 μL反應體系：dNTP mix（100 mmol/L）0.2 μL，Multiscribe逆轉(zhuǎn)錄酶（50 U/μL）1.0 μL，10×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μL，RNA酶抑制劑（20 U/μL）1 μL，去核酸酶水9.8 μL，混合逆轉(zhuǎn)引物1 μL引物，5 μL RNA。根據(jù)TaKaRa公司試劑盒說明書操作，輕輕混勻，短暫離心，冰上放置。RT—PCR反應條件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，5 min；4℃保存。

1.3.3 熒光定量PCR總反應體系為20μL：2×SYBR Green熒光定量預混液10 μL，上述擴增的cDNA（1∶20稀釋）2 μL，去核酸酶水7.0 μL，引物1 μL。通過Roche Light Cyeler 480實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行檢測。反應參數(shù)：95℃，1 min；95℃，15 s；60℃，45 s共40個循環(huán)。

1.4 統(tǒng)計學方法

3種miRNA表達結(jié)果以miR—22的表達水平為內(nèi)參，隨機以其中一個血清樣品為陽性對照。利用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件對實時熒光定量PCR檢測的相對表達量進行分析，表達量的相對比值以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

NSCLC患者與健康人群的血清RNA進行逆轉(zhuǎn)錄擴增后，行熒光定量PCR檢測各miRNA的表達量，以miR—22為內(nèi)參計算其相對比值。let—7、miR—125b—1表達量在NSCLC患者血清中均低于對照組，miR—21表達量顯著高于對照組（均為P < 0.01），見表1。其與健康對照者血清的比值平均為21.1%、13.5%、207.4%，見圖1。提示let—7、miR—125b—1、miR—21的表達水平可能成為NSCLC患者的血清標記物。

表1 三種miRNA在NSCLC患者與健康人群血清表達量（x±s）

圖1 三種miRNA在NSCLC患者與健康人群血清中的表達

3 討論

腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)與治療是降低其死亡率的關(guān)鍵。但多數(shù)腫瘤缺乏高度敏感和特異的標記物[4]，因此尋找腫瘤早期發(fā)生的標記物一直是腫瘤學研究的熱點。外周血腫瘤標記物的檢測具有幾乎無創(chuàng)、可進行重復多次測定的優(yōu)點，是腫瘤診斷的較理想手段。研究發(fā)現(xiàn)，外周血miRNA的表達具有腫瘤相關(guān)性與組織特異性的特點[5]。miRNA對外周血核糖核酸酶穩(wěn)定，因此較RNA更為穩(wěn)定，甚至在室溫下過夜、反復凍存—解凍、煮沸、過酸或過堿等條件下仍能穩(wěn)定表達[6]。故外周血miRNA可能是較理想的腫瘤標記物。

let—7是研究最多的與肺癌密切相關(guān)的miRNA。超過60%的肺癌組織與80%的肺癌細胞株中l(wèi)et—7的表達水平顯著降低[7]，并且let—7低表達的肺癌患者預后不良。國外研究發(fā)現(xiàn)，let—7在胚胎末期表達上調(diào)，在腫瘤早期表達降低[8]，且表達減少在NSCLC更為常見。Scott等發(fā)現(xiàn)let—7低表達是相對早期癌癥的標識[1]。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，let—7在KRAS 3′端非翻譯區(qū)的基因突變與NSCLC的好發(fā)有關(guān)[9]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，let—7在NSCLC患者外周血的水平僅為正常健康人群的21.1%，提示外周血let—7可能是一種較好的與NSCLC有關(guān)的腫瘤標記物。

miR—125b—1與肺癌的發(fā)生相關(guān)。此miRNA定位于11q23—24雜合型缺失的微小區(qū)域，后者在肺部、乳腺和卵巢腫瘤中存在突變或缺失。miRNA基因的突變或缺失可影響其表達水平。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，miR—125b—1在癌旁正常肺組織中無異常，在肺癌組織中存在基因突變，且miR—125b—1基因突變與癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期呈顯著正相關(guān)[10]。在本研究中，外周血miR—125b—1在肺癌患者中顯著降低，僅為健康人群的13.5%，提示miR—125b—1與肺癌的發(fā)生高度相關(guān)。

miR—21在多種腫瘤細胞中表達異常。在大多數(shù)腫瘤中，如惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、膽道癌、胰腺癌、直腸癌、膀胱癌及食管癌細胞或組織中，miR—21的表達均顯著升高。但在少數(shù)腫瘤，如卵巢癌、促腎上腺皮質(zhì)素分泌型垂體瘤等中表達明顯降低。研究發(fā)現(xiàn)，通過miR—21區(qū)分膽管癌與正常組織的靈敏度可達95%，提示miR—21可用于膽管癌的診斷[11]。通過計算miR—21與miR—205的表達量比值，可對侵襲性與非侵襲性的膀胱癌細胞進行有效的判別，其臨床靈敏度和特異性可分別達到100%和78%。在本研究中，NSCLC患者外周血miR—21大幅升高，提示其與肺癌的發(fā)生密切相關(guān)。但由于miR—21在多種腫瘤中高表達，其在外周血的表達水平與其他腫瘤的相關(guān)性尚需進一步研究。

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（收稿日期：2011—03—07）