劉瑩,趙杰,孫延芳

摘要：以水為溶劑提取接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）葉粗多糖，利用苯酚－硫酸比色法測(cè)定粗多糖的含量，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)考察提取溫度、提取時(shí)間、料水質(zhì)量比、乙醇濃度、提取次數(shù)以及提取液ｐＨ對(duì)多糖提取率的影響，并應(yīng)用正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，優(yōu)化的提取工藝為提取溫度７５ ℃、提取時(shí)間３ ｈ、料水質(zhì)量比１∶３０、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％，此條件下接骨木葉粗多糖的提取率為１５．５２％。

關(guān)鍵詞：接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ）；粗多糖；提取；優(yōu)化

中圖分類號(hào)：Ｒ２８４．２文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）05－0994-03

Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｅｒｂｅｒｒｙ Ｌｅａｖｅｓ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ

ＬＩＵ Ｙｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｊｉｅ，ＳＵＮ Ｙａｎ－ｆａｎｇ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｌｉａｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｆｕｘｉｎ １２３０００，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ） ｕｓｉｎｇ ｗａｔｅｒ ａｓ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｐｈｅｎｏｌ－ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ａｎｄ ｐＨ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｅｓｔｓ． Ａｎｄ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ， ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ７５ ℃； Eｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， 3 ｈ； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ ｗａｔｅｒ， １∶３０； Cｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ（volumn ratio）， ８０％， ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｃｏｕｌｄ ｂｅ １５．５２％．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｅｒｂｅｒｒｙ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）； ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ； ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ

接骨木（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｗｉｌｌｉａｍｓｉｉ Ｈａｎｃｅ）為忍冬科接骨木屬植物，又名續(xù)骨木、大接骨丹、公道老、扦扦活、馬尿騷等，分布于中國(guó)東北、華北、華東、華中、云南等地區(qū)［１－３］。接骨木化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣泛，臨床用于治療骨質(zhì)疏松和促進(jìn)骨折愈合療效顯著，是一種很有開(kāi)發(fā)價(jià)值的中藥材［４－１０］。多糖是其主要的藥用成分之一，具有抗感染、抗凝血、抗放射以及降血脂的功能，能夠有效地控制細(xì)胞分裂和分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與衰老［１１－１５］。本研究以水為溶劑提取接骨木多糖，并用苯酚－硫酸比色法測(cè)定多糖含量，對(duì)接骨木葉粗多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，以期為接骨木有效成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

１材料與方法

１．１試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)采用阜新地區(qū)的接骨木，２０１０年９月采集，選擇無(wú)病蟲(chóng)害的葉片，清洗干燥后備用。濃硫酸、苯酚、蔗糖等試劑均為分析純，購(gòu)于沈陽(yáng)國(guó)藥公司。７５２紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）、高速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）、冷凍干燥機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司中佳分公司）、組織搗碎機(jī)（上海嘉定糧油儀器有限公司）。

１．２方法

１．２．１標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作?。保爸г嚬?，配制蔗糖含量分別為０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ μｇ／ｍＬ的蔗糖溶液，然后向試管內(nèi)加入１ ｍＬ體積分?jǐn)?shù)為９％的苯酚溶液，振蕩搖勻，再?gòu)墓芤赫嬉裕怠玻?ｓ的速度向液面逐滴加入５ ｍＬ濃硫酸，繼續(xù)振蕩搖勻，直至溶液完全混合，顏色均勻。比色液總體積約為８ ｍＬ，在恒溫下放置３０ ｍｉｎ，顯色，然后以蒸餾水為參比，在４８５ ｎｍ波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［２，３］。得到蔗糖含量（Ｘ//μｇ/ｍＬ）對(duì)吸光度Ａ４８５ ｎｍ（Ｙ）的直線回歸方程Ｙ＝０．０１７ ５Ｘ＋０．０３６ ９，相關(guān)系數(shù)Ｒ２＝０．９９４，說(shuō)明在所取的濃度范圍內(nèi)蔗糖濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系。

１．２．２接骨木葉多糖提取工藝流程取備用的接骨木葉，經(jīng)脫脂、脫色、脫蛋白等處理，然后采用水提醇沉法提取多糖，絮狀沉淀經(jīng)乙醇、乙醚、丙酮洗滌后冷凍干燥，得到粗多糖。

１．２．３單因素試驗(yàn)分別考察提取溫度、提取時(shí)間、料水質(zhì)量比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)多糖提取率的影響［４］。①提取溫度。精確稱取１．０ ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，分別在６５、７５、８５、９５ ℃的恒溫水浴中提?。?ｈ，過(guò)濾、收集上清液，測(cè)定其Ａ４８５ ｎｍ，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算溶液中多糖的濃度，并計(jì)算接骨木葉粗多糖的提取率（粗多糖提取率＝提取所得粗多糖的質(zhì)量／脫脂接骨木粉末質(zhì)量×１００％）。②提取時(shí)間。精確稱?。保?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒溫水浴中分別提取１、２、３、４、５ ｈ后過(guò)濾，收集上清液，測(cè)定其Ａ４８５ ｎｍ，計(jì)算接骨木葉粗多糖的提取率。③料水質(zhì)量比。精確稱?。保?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，分別加入１５、２０、２５、３０、３５ ｍＬ蒸餾水，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．０，然后在７５ ℃恒溫水浴中提取２ ｈ后過(guò)濾，收集上清液，測(cè)定其Ａ４８５ ｎｍ，計(jì)算接骨木葉粗多糖的提取率。④乙醇體積分?jǐn)?shù)。精確稱?。保埃?ｇ脫脂接骨木葉粉末５份，各加入２５ ｍＬ蒸餾水，７５ ℃恒溫水浴中提?。?ｈ，水浴后過(guò)濾，收集上清液，減壓濃縮，分別加入體積分?jǐn)?shù)為５０％、６０％、７０％、８０％、９０％的乙醇溶液，在４ ℃下沉淀過(guò)夜后３ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，棄去上清液，收集沉淀，真空干燥，稱取所得粗多糖的質(zhì)量，計(jì)算粗多糖得率。

１．２．４正交試驗(yàn)［５］結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)Ｌ９（３４）正交試驗(yàn)，對(duì)影響粗多糖得率的提取溫度、提取時(shí)間、料水質(zhì)量比和乙醇體積分?jǐn)?shù)４個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表１。

２結(jié)果與分析

２．１單因素試驗(yàn)結(jié)果

２．１．１提取溫度對(duì)接骨木葉粗多糖提取率的影響在６５～７５ ℃的溫度范圍內(nèi)，粗多糖提取率隨著提取溫度的升高而升高，提取溫度為７５ ℃時(shí)，粗多糖提取率最高，提取溫度高于７５ ℃時(shí)，粗多糖提取率隨溫度的升高而下降（圖１）?？梢?jiàn)較高的提取溫度有利于多糖的溶出，但過(guò)高的溫度會(huì)使粗多糖降解，反而不利于提高提取率。

２．１．２提取時(shí)間對(duì)接骨木葉粗多糖提取率的影響在２ ｈ內(nèi)，粗多糖提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)２ ｈ時(shí)，提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)緩慢下降（圖２），可能是因?yàn)榻庸悄救~中的多糖充分溶出之后，再增加提取時(shí)間會(huì)導(dǎo)致溶液中的多糖降解，從而使提取率下降。

２．１．３料水質(zhì)量比對(duì)接骨木葉粗多糖提取率的影響接骨木葉粗多糖的提取率先隨溶劑水用量的增加而增加（圖３），在料水質(zhì)量比為１∶２５時(shí)粗多糖提取率達(dá)到最大，此時(shí)大部分多糖已溶出，再增加水的用量，多糖提取率增加不明顯，甚至有所降低，且不利于后續(xù)試驗(yàn)操作。

２．１．４乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)接骨木葉粗多糖提取率的影響醇沉?xí)r使用的乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)粗多糖提取率有較大影響（圖４）。粗多糖提取率先隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而升高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為８０％時(shí)粗多糖提取率最高。乙醇體積分?jǐn)?shù)為９０％時(shí)粗多糖提取率反而有所降低。其原因可能是較高的乙醇溶液濃度有利于多糖的沉淀，但濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致部分多糖分子與醇溶蛋白相結(jié)合，從而溶于乙醇溶液中，不被沉淀，同時(shí)一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加，共同導(dǎo)致了粗多糖提取率的降低。

２．２正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果（表２），各因素對(duì)接骨木葉粗多糖提取率的影響順序?yàn)樘崛囟取⑻崛r(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料水質(zhì)量比，提取率最高的試驗(yàn)組合為Ａ１Ｂ３Ｃ２Ｄ２，即提取溫度７５ ℃、料水質(zhì)量比１∶３０，提取時(shí)間３ ｈ、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，所得多糖提取率為１５．５２％，高于正交試驗(yàn)組合，說(shuō)明正交試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

３結(jié)論

以粉碎脫脂后的接骨木葉為原料，以水為溶劑提取粗多糖，設(shè)置單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，結(jié)果表明，在提取溫度７５ ℃、提取時(shí)間３ ｈ、料水質(zhì)量比１∶３０、乙醇體積分?jǐn)?shù)８０％的條件下，提取接骨木葉粗多糖，提取率可達(dá)１５．５２％。

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