鄭琴芳 汪賽嬌 周丐曉 鄭蔚虹

摘 要 本實驗利用ISSR分子標記技術研究5個中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem&Chen）居群的遺傳多樣性。從40個隨機引物中篩選出8個有效引物，共擴增出69個可分析位點，其中多態(tài)位點65個，多態(tài)性條帶比率（PPL）為94.20%。實驗表明基因分化系數(shù)（Gst）平均值為0.0622，居群間的基因流（Nm）為7.5378，上述結果表明中國水仙居群的遺傳變異大部分存在于居群內部，5個居群間的基因交流很高，種群間的分化很少。

關鍵詞 中國水仙 居群 ISSR 遺傳多樣性

中圖分類號：S688文獻標識碼：A

ISSR Analysis on Chinese Narcissus Group Genetic Diversity

ZHENG Qinfang, WANG Saijiao, ZHOU Gaixiao, ZHENG Weihong

(College of Life and Environmental Sciences, Wenzhou University, Wenzhou, Zhejiang 325000)

Abstract In this study, study on ISSR markers of five Chinese narcissus (Narcissus that tazetta var chinensis, the Boem & Chen) population genetic diversity. The eight primers selected from 40 random primers amplified a total of 69 analyzed sites of polymorphic loci and 65, the percentage of polymorphic bands (PPL) is 94.20%. Experiments show that the average gene differentiation coefficient (Gst) was 0.0622, gene flow among populations (Nm) 7.5378, the above results show that Xianju group of Chinese water most of the genetic variation within populations, five genes among populations the exchange of high population differentiation.

Key words Chinese narcissus; droup; ISSR; genetic diversity

中國水仙（Narcissus tazetta var. chinensis Boem &Chen）為石蒜科（Amaryllidaceae）水仙屬多花水仙的一個變種，主要分布在我國的福建、浙江、江蘇和臺灣、上海等地。中國水仙栽培歷史悠久，但是由于中國水仙為三倍體，很難自然和人工雜交產生新品種，而且新品種培育困難，導致數(shù)百年來中國水仙品種稀少，少有創(chuàng)新，乃中國水仙一大遺憾。并且近年來中國水仙野生資源喪失嚴重。因此，很有必要對中國水仙的遺傳多樣性進行深入研究。

簡單序列重復間區(qū)（inter-simple sequence repeat，ISSR）是目前常用的分子標記技術。ISSR是在SSR的3端或5端加錨1~4個嘌呤或嘧啶堿基，并以此作為引物，一般為16~18個堿基序列，對兩側具有反向排列SSR的一段DNA序列進行擴增。再根據譜帶的有無及相對位置，來分析不同樣品間的多態(tài)性。這種分子標記方法具有簡便、耗資少、模板DNA用量少、多態(tài)性高等優(yōu)點，已廣泛用于生物品種和居群間的遺傳多樣性研究。

1 材料和方法

1.1 植物材料

實驗材料中國水仙的采集均利用植物遺傳多樣性的策略進行。每個居群采取20~30個體的葉片，分別裝袋，硅膠干燥，并置于-70℃超低溫冰箱中保存、備用。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

采用Biospin植物基因組DNA試劑盒法提取，具體操作步驟參照廠家說明。每個居群20個樣本，共提取100個DNA基因組。

1.2.2 PCR擴增

在預備實驗中，對40個ISSR引物進行篩選，各選出8個能擴增出條帶清晰且具多態(tài)性帶型的引物。根據PCR正交試驗設計，選取最佳組合的反應濃度。25 L ISSR-PCR體系中，dNTP的濃度200 mol·L-1，引物濃度1.6 mol·L-1，Mg2+濃度2.0mmol·L-1，TaqDNA 聚合酶1.5U，模板DNA濃度為9 ng/ L。

ISSR擴增程序：94℃預變性5min，94℃變性30s，52~60℃退火1min，72℃延伸1min30s，進行40個循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸7min。

PCR反應產物經含有NA-red染料（2000：1）的1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，最后用凝膠成像系統(tǒng)（UVP）記錄實驗結果。

圖1 引物ISSR-824擴增的ISSR帶型

1.2.3 數(shù)據分析

將記錄的圖譜于Labworks 4.6軟件中進行分析。同一引物在相同位點，根據條帶的有（1）無（0）得到二元資料，形成0，1矩陣；在POPGENE32軟件中進行分析，計算出樣品間的Nei s相似性系數(shù)，并構建五個種群的系統(tǒng)樹。

2 結果與分析

2.1 ISSR-PCR擴增

8個ISSR引物共擴增得到4886條譜帶，檢測到的清晰而且可重復的有效位點為69個，其中多態(tài)性條帶65個，占總帶數(shù)的94.20%；如圖1所示為issr-824引物對5個居群水仙的擴增結果。每個引物擴增出的DNA片段為7~10個，平均8.62個；各位點的DNA片段長度集中在200~2000 bp之間。

2. 2 5個居群水仙的聚類分析

圖2 基于中國水仙種群間Neis無偏差遺傳距離構建的UPGMA 聚類圖

利用 POPGENE32軟件計算中國水仙種群間的Neis無偏差遺傳距離（D）和遺傳一致度（I）。ISSR標記中，五個中國水仙種群間的Neis 無偏差遺傳距離在0.0229~0.0583之間（表1）。最后根據Neis遺傳一致度和遺傳距離，形成一個樹型的UPGMA聚類圖（圖2）。

從圖2可以看出在ISSR標記中，南麂一區(qū)和南麂二區(qū)兩種群之間遺傳距離最?。― = 0.0229），兩者之間的遺傳相似系數(shù)最大（I = 0.9774），首先聚為一類；接著是上海崇明和舟山普陀；最后和福建平潭聚在一起。以上聚類圖進一步揭示了水仙居群的分化趨勢和親緣關系。其中最高遺傳相似系數(shù)（I = 0.9774）與最低遺傳相似系數(shù)（I = 0.9434）相差僅0.0340，這表明5個種群之間有著較高的相似性，遺傳背景較為接近。

表1 中國水仙種群間的 Neis無偏差遺傳距離（對角線以下）及遺傳相似系數(shù)

3 討論

實驗結果顯示，5個中國水仙居群，共100個樣品基因組有較豐富的多態(tài)性。本文也得出中國水仙種群間有著較高的相似性，其遺傳背景也較為接近，這與陳林姣、吳菁華等人所揭示的水仙品種親緣關系較為密切，遺傳背景基本一致的結論相同。根據各居群的Neis遺傳距離所繪制的UPGMA樹狀聚類圖可得出，各居群的地理位置對遺傳距離有一定的影響作用。南麂一區(qū)和南麂二區(qū)的距離最近，首先聚為一類；上海崇明和舟山普陀的距離次之，聚為第二類；最后和地理位置最遠的福建平潭聚在一起。地理較近的居群聚在一起，表現(xiàn)出比較明顯的地域性，說明各居群的親緣關系與地理分布有著密切的關系。