彭圓 程靜 李偉 嚴(yán)進(jìn) 田代志 郭嵐 王平

[摘要]目的：觀察便秘模型小鼠的皮膚老化,為肺與大腸相表里的歸經(jīng)藥物研究提供動(dòng)物模型。方法：以空白組和D-半乳糖致衰模型作對(duì)照，采用限水（1.5ml/天），疊加復(fù)方地芬諾酯(10mg/kg·d)灌胃6周建立便秘模型。通過小腸墨汁推進(jìn)率、大腸和皮膚含水率判斷便秘模型是否成功，同時(shí)進(jìn)行血清、皮和肺超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、皮膚組織羥脯氨酸(Hydroproline，HYP)及透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid,HA）含量、皮膚的光鏡檢測(cè)。結(jié)果：與空白組比較，便秘組各項(xiàng)指標(biāo)顯示有顯著性差異（P<0.01）。小腸推進(jìn)率明顯下降（P<0.01）；大腸和皮膚含水率下降（P<0.01）；皮膚明顯變薄，膠原纖維數(shù)量減少；血清、皮膚及肺組織中SOD活力明顯下降（P<0.01），皮膚組織中HYP含量減少（P<0.01）；皮膚組織勻漿中HA含量銳減（P<0.01）。與衰老模型組比較，無(wú)顯著性差異。結(jié)論：便秘可導(dǎo)致皮膚衰老?？寡趸芰ο陆蹬c皮膚組織HA含量減少可能是該便秘模型小鼠皮膚菲薄、干燥的病理機(jī)制。

[關(guān)鍵詞]便秘；皮膚；衰老；小鼠模型

[中圖分類號(hào)]R332R758 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）06-0947-03

衰老與便秘相關(guān)，已為歷代醫(yī)家所論述。如《論衡》中有“欲得長(zhǎng)生，腸中常清；欲得不死，腸中無(wú)滓”?！侗怡o心書·便閉》：“老人氣虛，及婦人產(chǎn)后血少，致津液不行，不得通流，故大便常結(jié)?！薄夺t(yī)宗必讀》云:“老年津液干枯…皆能便結(jié)”等。各種原因引起的便秘，其病位雖在大腸，由于五臟一體觀之肺系統(tǒng)中大腸、皮毛與肺互為聯(lián)絡(luò)，如《素問·五臟生成》云：“肺之合皮也，其榮毛也”?！鹅`樞·本藏》曰: “肺合大腸, 大腸者, 皮其應(yīng)”?！鹅`樞·本輸》云：“肺合大腸。大腸者，傳導(dǎo)之官”。故而大腸的病變常與肺的病變相關(guān)聯(lián)，同時(shí)“肺與皮毛相合”，肺與皮膚的病變也常互為影響，所以大腸與皮膚在病理上也有緊密的聯(lián)系。盡管近年來(lái)，對(duì)“肺與大腸相表里”的理論認(rèn)識(shí)在不斷加深，但從皮膚衰老角度進(jìn)行其相關(guān)性研究并不多見。因此本研究以便秘模型動(dòng)物為對(duì)象，觀察其皮膚的老化現(xiàn)象，旨為肺與大腸相表里的歸經(jīng)藥物研究提供動(dòng)物模型。

1材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料

1.1.1 動(dòng)物：2月齡昆明清潔級(jí)小鼠62只，（20±2）g，雌雄各半，購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品：復(fù)方地芬諾酯(10mg/ kg·d)，江蘇平光制藥有限責(zé)任公司；D-半乳糖，張家港市華昌藥業(yè)有限公司，用超純水配成濃度為10%， 4℃冷藏備用。

1.1.3 主要器材：AL104型電子天平；DHG90A系列鼓風(fēng)干燥箱；721型分光光度計(jì)； FSH-Ⅱ型可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)；TGL-16G-A型低溫離心機(jī)(AnKe)；GC-1200r放免計(jì)數(shù)儀；RM2135 型旋轉(zhuǎn)切片機(jī)；TB-718E型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)；Motic BA300數(shù)碼光學(xué)顯微鏡。

1.1.4 主要試劑:超氧化物歧化酶（SOD）、羥脯氨酸（HYP）、考馬斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。透明質(zhì)酸放射免疫分析檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所。蘇木素液、伊紅染色液、乙醇、二甲苯、多聚甲醛購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 分組造模與處理: 將62只2月齡昆明清潔級(jí)小鼠，稱重后按性別隨機(jī)分為空白組、便秘組、衰老組。用苦味酸標(biāo)記。其中便秘組22只，其余組各20只?？瞻捉M常規(guī)攝食、飲水及光照。衰老組參照文獻(xiàn)[1]按1000mg/kg·d于頸背部皮下注射D-半乳糖，制備亞急性衰老動(dòng)物模型。便秘組參照文獻(xiàn)[2-3]略做改進(jìn)，采用限水（正常小鼠日需水量的1/3即1.5ml），疊加復(fù)方地芬諾酯(10mg/kg·d)灌胃建立復(fù)合便秘模型，灌胃順序依次為超純水（20ml/kg·d）、復(fù)方地芬諾酯（10ml/ kg·d）、超純水（補(bǔ)充余量），間隔3h；空白組以超純水做對(duì)照；共6周。實(shí)驗(yàn)過程中便秘組有2只死亡。

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后于第43天每組一半做墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn)，另一半做其余實(shí)驗(yàn)。行眼眶取血，常規(guī)離心制備血清；行兩肩胛至兩髂骨之間的備皮，在冰上取備皮后的背部皮膚組織塊和開胸后肺組織, 制備10%組織勻漿，-20℃冰箱貯存?zhèn)溆?；剪取上自回盲部、下至直腸的腸管，去除內(nèi)容物后用萬(wàn)分之一電子天平精確稱其濕重；在冰上取背部2cm×2cm大小皮膚，用萬(wàn)分之一電子天平精確稱其濕重；取背部正中0.5cm×0.5cm大小皮膚，迅速放入4％多聚甲醛中固定進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.3 標(biāo)本制備及檢測(cè)

1.3.1 小腸墨汁推進(jìn)功能檢測(cè)(墨汁推進(jìn)實(shí)驗(yàn))：在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后禁食20h。將墨汁與各組灌胃的液體物質(zhì)按1：2體積比配制。參照文獻(xiàn)[4]，計(jì)算墨汁推進(jìn)率(%)=〔墨汁推進(jìn)長(zhǎng)度(cm)/小腸總長(zhǎng)度(cm)〕×100%。

1.3.2 大腸及皮膚含水率實(shí)驗(yàn)：稱濕重后的腸管放到80℃干燥箱中烘3h至恒重，稱取干重；將稱濕重后的皮膚放到80℃干燥箱中烘12h，稱取干重，計(jì)算組織含水率。組織含水率(%)=（組織濕重-組織干重）／組織濕重×100%。

1.3.3血清、皮膚及肺組織SOD活性檢測(cè)：采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性測(cè)定?？捡R斯亮蘭蛋白測(cè)定試劑盒并檢測(cè)皮膚蛋白含量。

1.3.4 皮膚HYP含量及透明質(zhì)酸含量的測(cè)定：采用樣本堿水解法檢測(cè)HYP含量。由湖北中醫(yī)附院核醫(yī)學(xué)科采用放免法測(cè)定HA含量。

1.3.5皮膚組織學(xué)觀察：固定24h后常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，石蠟切片、脫蠟、脫水、HE染色，光鏡下觀察，顯微攝影（攝像頭：MOTICAM 3000）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS15.0 for Windows 軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)用 表示，組間比較用方差分析并用最小顯著差法(LSD)做兩兩比較。當(dāng)各組方差不齊時(shí)用Dunnetts''''C法做兩兩比較。

2結(jié)果

2.1 便秘模型小鼠腸道傳輸功能及含水實(shí)驗(yàn)、皮膚含水功能檢測(cè)：見表1，可以看出,與空白組比較，便秘組小腸墨汁推進(jìn)率、大腸含水率、皮膚組織含水率及皮膚HA均顯著降低（P<0.01）。便秘組與衰老組比較，無(wú)顯著性差異。

2.2 便秘模型小鼠抗氧化能力檢測(cè)：見表2，可以看出,與空白組比較，便秘組血清中SOD活性顯著降低（P<0.01）；皮膚SOD活性、羥脯氨酸含量均顯著降低（P<0.01）；肺SOD活性均顯著降低（P<0.01）。便秘組與衰老組比較，無(wú)顯著性差異。

2.3 皮膚組織HE染色結(jié)果：空白組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)完整。表皮與真皮界線清晰，表皮薄，較規(guī)則；真皮層厚，膠原纖維豐富交錯(cuò)排列，大量成纖維細(xì)胞可見；皮下未見脂肪細(xì)胞填充。與空白組比較，衰老組小鼠皮膚變薄，結(jié)構(gòu)完整。表皮薄，真皮膠原纖維數(shù)量減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，皮下脂肪層細(xì)胞填充明顯增多，厚達(dá)6～9層。與空白組比較，便秘組小鼠皮膚變薄，結(jié)構(gòu)完整。表皮薄，真皮膠原纖維數(shù)量減少，成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，皮下脂肪細(xì)胞填充較少，僅1～2層。

3討論

3.1 由于機(jī)體本身的代償機(jī)制存在，當(dāng)短期限水或禁水時(shí)，容易自然恢復(fù)，故本課題在借鑒前人研究成果的基礎(chǔ)上,對(duì)復(fù)方地芬諾酯模型和短期限水模型加以改進(jìn)，建立連續(xù)6周限水（僅維持小鼠正常日需水量的1/3）加大劑量復(fù)方地芬諾酯（10mg/ kg·d）并用的復(fù)合便秘模型。結(jié)果顯示該模型小鼠已出現(xiàn)明顯的小腸墨汁推進(jìn)率與大腸含水的降低，可見復(fù)合因素造模后，模型動(dòng)物出現(xiàn)了腸道傳輸功能明顯下降，大腸含水量顯著降低。不僅如此，皮膚含水量也明顯減少。這與臨床腸燥津虧證的一般特點(diǎn)如皮膚干燥、大便干結(jié)難解等類似。對(duì)皮膚含水功能進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)模型鼠皮膚中HA含量明顯減少，可能是導(dǎo)致皮膚組織含水減少，出現(xiàn)皮膚干燥變薄表象的原因之一。

3.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，便秘不僅使消化道處于創(chuàng)傷應(yīng)激中心地位，還可加劇體內(nèi)的氧自由基反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，削弱機(jī)體對(duì)抗自由基的能力[5]，這與本實(shí)驗(yàn)抗氧化能力結(jié)果一致。其中血清與肺SOD活性檢測(cè)的結(jié)果提示，模型鼠對(duì)抗氧自由基的能力銳減，使暴露于有氧環(huán)境中肺成為氧化應(yīng)激發(fā)生的一個(gè)重要位點(diǎn)，從而參與機(jī)體衰老的發(fā)展進(jìn)程。

3.3 大量流行病學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)研究支持氧化應(yīng)激損傷是皮膚衰老主要機(jī)制之一[6-8]。本研究抗氧化能力的結(jié)果還顯示，模型鼠皮膚SOD 活性明顯下降，皮膚HYP含量顯著降低，且與鏡下皮膚變薄真皮膠原纖維數(shù)量減少的形態(tài)學(xué)變化結(jié)果保持一致，表明便秘模型動(dòng)物體內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)。其抗氧化防御能力的下降，是導(dǎo)致皮膚細(xì)胞損傷加劇、皮膚老化的一大機(jī)制。

3.4 中醫(yī)認(rèn)為人體是一個(gè)有機(jī)整體?！安刂趦?nèi)必象之于外”，通過觀測(cè)皮膚改變，可以洞察體內(nèi)臟腑的功能狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)通過皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察及定量分析和皮膚抗衰老指標(biāo)的檢測(cè)，結(jié)果證明，該模型小鼠皮膚中各項(xiàng)指標(biāo)變化與D-半乳糖致亞急性衰老模型皮膚的改變相一致,無(wú)顯著性差別，從而說明便秘可以導(dǎo)致衰老，可成為皮膚衰老的一大誘因。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)方地芬諾酯灌胃疊加飲水限制，造成了與臨床相符的腸燥津虧證便秘動(dòng)物模型?？寡趸芰ο陆蹬c皮膚組織HA含量減少可能是該便秘模型小鼠皮膚菲薄、干燥的病理機(jī)制?；诖竽c、皮毛與肺互為聯(lián)絡(luò)關(guān)系，本模型從皮膚衰老角度初步為“肺與大腸相表里”研究提供了新思路，值得深入“肺與大腸相表里”的歸經(jīng)藥物研究。

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[收稿日期]2012-02-21[修回日期]2012-04-07

編輯/張惠娟