方木平 葉文正 王珊珊 吳一文

[摘要]目的：探討PCNA和PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌（SCC）中的表達(dá)情況，研究其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。方法：采用免疫組化SP法檢測(cè)52例皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和10例正常皮膚組織石蠟標(biāo)本中PCNA和PTEN蛋白的表達(dá)。結(jié)果：在SCC標(biāo)本中，PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于正常皮膚組織，PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于正常皮膚組織（P<0.005）。PCNA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)呈明顯正相關(guān)（r=0.484），PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)與病理分級(jí)呈明顯負(fù)相關(guān)（r=0.507），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.005）；在低分化SCC標(biāo)本中，PCNA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率高于高中分化組，PTEN蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率低于高中分化組（P均<0.001）； PCNA與PTEN蛋白的表達(dá)存在明顯的負(fù)相關(guān)（r=0.557）；兩者表達(dá)均與年齡和部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論：在SCC 組織標(biāo)本中，PCNA強(qiáng)表達(dá)，PTEN低表達(dá)或失表達(dá)，在SCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，二者對(duì)于判斷SCC的進(jìn)展和預(yù)后具有重要的臨床意義。

[關(guān)鍵詞]癌；鱗狀細(xì)胞；PCNA；PTEN；免疫組化

[中圖分類號(hào)]R739.5[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1008-6455（2012）06-0936-03

PCNA是一種細(xì)胞增殖相關(guān)核抗原，在細(xì)胞周期調(diào)節(jié)過(guò)程中起重要作用，在增殖細(xì)胞和高度惡性腫瘤中表達(dá)增強(qiáng)；PTEN是迄今發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，主要通過(guò)脫磷酸化作用調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育及抑制腫瘤增殖、粘附、轉(zhuǎn)移。本研究采用免疫組化SP法檢測(cè)皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織和正常皮膚組織石蠟標(biāo)本中PCNA和PTEN蛋白的表達(dá)情況，試圖探討其表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。

1資料和方法

1.1 一般資料：收集本院皮膚科和病理科于2005年1月～2011年12月手術(shù)切除的76例疑似鱗狀細(xì)胞癌組織標(biāo)本，病歷資料完整和病理診斷明確的52例。男23例，女29例；年齡41～80歲，平均65.2±2.1歲，病程3個(gè)月～11年（平均1.3±0.4年）。按Broders病理分級(jí)法將其分為：Ⅰ級(jí)12例，Ⅱ級(jí)15例，Ⅲ級(jí)14例，Ⅳ級(jí)11例。Ⅰ級(jí)為高分化鱗癌，Ⅱ級(jí)為中分化鱗癌，Ⅲ級(jí)～Ⅳ級(jí)為低分化鱗癌。另選取10例皮膚外科手術(shù)室切除的正常皮膚組織標(biāo)本作為對(duì)照組，男4例，女6例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑：鼠抗人PCNA單克隆抗體（克隆號(hào)PC10）與PTEN單克隆抗體（克隆號(hào)28H6）和SP免疫組化試劑盒（濃縮型）均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法：采用免疫組化SP法，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，用PBS液代替一抗作陰性對(duì)照，用已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3結(jié)果判定：由2位病理科醫(yī)師和1位皮膚科病理醫(yī)師共同評(píng)判。標(biāo)準(zhǔn)如下：①PCNA與PTEN根據(jù)著色強(qiáng)弱，染色強(qiáng)弱以多數(shù)細(xì)胞的呈色反應(yīng)為準(zhǔn)：不著色為0分，淺黃色為1分，深黃色為2分，棕黃色為3分；②低倍鏡下選取細(xì)胞分布均勻的視野，高倍鏡視野下用HMIAS高清晰病理彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，每張切片在×40高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比均值：<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。根據(jù)上述兩項(xiàng)的記分之和將PCNA和PTEN蛋白陽(yáng)性結(jié)果分為4級(jí)：陰性（-）為＜2分，弱陽(yáng)性（+）為＜3分，陽(yáng)性（2+）為3～4分，強(qiáng)陽(yáng)性（3+）為＞4分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS13.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)、Fisher確切概率法，組間比較采用單因素方差分析，用直線相關(guān)分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)，并判定其相關(guān)程度。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 PCNA蛋白在SCC中的表達(dá)： PCNA蛋白主要表達(dá)于癌細(xì)胞核，少數(shù)表達(dá)于細(xì)胞漿（圖1）。在SCC中，PCNA蛋白的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常皮膚組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)；PCNA在不同病理分級(jí)間表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.001），且PCNA蛋白表達(dá)與病理分級(jí)存在相關(guān)性（r=0.484）。通過(guò)兩兩比較，研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ級(jí)和Ⅲ級(jí)間，Ⅰ級(jí)和Ⅳ級(jí)間PCAN表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。將Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)分別進(jìn)行合并，并比較兩組間表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)低分化（Ⅲ+Ⅳ）級(jí)組PCAN表達(dá)高于高中（Ⅰ+Ⅱ）組（P<0.001）；研究結(jié)果提示病理分級(jí)越高，癌分化越差，PCNA蛋白表達(dá)越強(qiáng)。在增生活躍的正常表皮基底層中，僅有少數(shù)弱表達(dá)PCNA蛋白（1例，占10%)（圖2）；與患者的年齡與部位無(wú)關(guān)（P＞0.05）（表1）。

2.2 PTEN蛋白在SCC中的表達(dá)：PTEN蛋白主要表達(dá)于正常細(xì)胞（圖3），在SCC中的陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于正常皮膚組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.005)，與患者的年齡和部位無(wú)關(guān)（P>0.05）。PTEN在不同病理分級(jí)間表達(dá)也有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.005），且存在相關(guān)性（r=0.507）。通過(guò)兩兩比較，研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ級(jí)和Ⅲ級(jí)間，Ⅰ級(jí)和Ⅳ級(jí)間PTEN表達(dá)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)表達(dá)均低于Ⅰ級(jí)表達(dá)。同樣將Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)，Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)分別進(jìn)行合并，低分化（Ⅲ+Ⅳ）級(jí)組PTEN表達(dá)低于（Ⅰ+Ⅱ）級(jí)組（P<0.001），提示病理分級(jí)越高，癌分化越差，PTEN的表達(dá)越弱。但是有1例Ⅲ級(jí)鱗狀細(xì)胞癌的PTEN蛋白強(qiáng)表達(dá)（圖4、表1）。

2.3 皮膚鱗狀細(xì)胞癌中PCNA和PTEN表達(dá)的關(guān)系：在SCC中，PCAN和PTEN的表達(dá)陽(yáng)性率存在差異性（P<0.05），從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)看，在PCNA 高表達(dá)組往往有PTEN低表達(dá)，34例PTEN低或失表達(dá)組中，PCNA 高表達(dá)的有29例（占85.29%），說(shuō)明兩者之間可能存在負(fù)相關(guān)。通過(guò)進(jìn)一步研究?jī)煞N表達(dá)結(jié)果是否存在關(guān)聯(lián)性，計(jì)算得到P<0.05，說(shuō)明兩種表達(dá)之間存在關(guān)聯(lián)性, Pearson列聯(lián)系數(shù)r=0.557，說(shuō)明兩者間中度關(guān)聯(lián)（表2）。

3討論

近年來(lái)研究表明，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤(rùn)與多種癌基因強(qiáng)表達(dá)和抑癌基因低表達(dá)或失表達(dá)密切相關(guān),是一種多基因、多因素相關(guān)性疾病。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要特性，是影響預(yù)后的重要因素，尋找有價(jià)值的預(yù)測(cè)預(yù)后及指導(dǎo)臨床治療的生物學(xué)指標(biāo)已成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。

PCNA是 DNA復(fù)制時(shí)所必需的調(diào)節(jié)蛋白，是與細(xì)胞增殖周期有關(guān)的周期蛋白，在 DNA 復(fù)制及細(xì)胞分裂過(guò)程中不可或缺。其表達(dá)在 G1期開(kāi)始增高，S期達(dá)到高峰，G2期和 M期明顯下降[1]。PCNA 的陽(yáng)性程度可直接反應(yīng)出 DNA 復(fù)制的活躍程度[2-3]。本研究結(jié)果顯示，在正常組織中，PCNA 的表達(dá)較低；高中分化組陽(yáng)性率與低分化組陽(yáng)性率之間有顯著性差異，與Yamazaki[4]等的研究結(jié)果相似。隨著SCC的病理分級(jí)增高，PCNA 的表達(dá)明顯增強(qiáng)。提示 PCNA 可促進(jìn)細(xì)胞增殖，并加速腫瘤惡變。本研究結(jié)果也顯示，在SCC中PCNA與PTEN的表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，提示二者之間可能以負(fù)反饋調(diào)節(jié)方式參與SCC的發(fā)生發(fā)展。

PTEN是繼p53基因后被發(fā)現(xiàn)的一種能識(shí)別腫瘤的抑制基因，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡、黏附、遷移和浸潤(rùn)等方面有重要作用。PTEN蛋白失表達(dá)與一些惡性腫瘤的生物學(xué)行為和預(yù)后密切相關(guān)，陽(yáng)性表達(dá)者多分化好、浸潤(rùn)較淺、不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后良好[5-7]。大量研究證明，PTEN 蛋白在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，且表達(dá)的水平與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明PTEN 與多種惡性腫瘤如：胃癌、宮頸癌、間皮瘤等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8-9]。本研究結(jié)果顯示，PTEN 在正常組織中表達(dá)率遠(yuǎn)高于SCC中表達(dá)率,提示PTEN表達(dá)下調(diào)與SCC的發(fā)生有關(guān)。其中高中分化組與低分化組為之間有顯著性差異，隨著病理分級(jí)的升高，陽(yáng)性率呈遞減趨勢(shì)，也提示了該基因在誘導(dǎo)腫瘤分化過(guò)程中起重要作用。因此PTEN 蛋白的檢測(cè)不僅有助于了解SCC發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制,而且對(duì)判斷患者的預(yù)后等可提供參考價(jià)值，為臨床治療等提供新的方向。本研究也表明，PCNA與PTEN在SCC中的表達(dá)與患者的年齡、發(fā)病部位沒(méi)有關(guān)系。

PCNA 的過(guò)表達(dá)與PTEN 的失表達(dá)是SCC侵襲和轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。聯(lián)合檢測(cè)PCNA和PTEN蛋白可以為臨床診斷、確定治療方案以及預(yù)后評(píng)估提供重要參考指標(biāo)，也可為手術(shù)或放射治療SCC提供依據(jù)，減輕患者痛苦。有可能也為血管抑制劑、局部注射抑癌因子治療SCC提供了理論依據(jù)。但PCNA 和PTEN的表達(dá)在SCC增殖和轉(zhuǎn)化中的相互間的調(diào)節(jié)與作用機(jī)制還有待于更深層次的研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Taftachi R, Ayhan A, Ekici S, et al. Proliferating-cell nuclear anti2gen ( PCNA) as an independent prognostic marker in patients after prostatectomy: a comparison of PCNA and Ki267[J].BJU Int, 2005,95(4):650-654.

[2]任海霞,閆春梅,王卡娜,等.宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中PTEN、PCNA的表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2008.48(43):17-18.

[3]Deniz K,Yuce I,Cagli S, et al. Expression of PCNA and bcl-2 in basaloid squamous cell carcinoma of the larynx: a controlled study[J].Ear Nose Throat J,2008, 87(8):469-473.

[4]Yamazaki K,Kumamoto Y,Tsukamoto T.Expression of squamous cell carcinoma-associated antigen in bladder cancer cells--a comparative study with the expression of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) [J].Nihon Hinyokika Gakkai Zasshi,1994,85(4):589-598.

[5]方木平,易海英,劉漢忠. P105,CD105和 PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2011,25(12):934-937.

[6]方木平,易海英,劉漢忠.P105和PTEN在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué),2012.21(1):61-63.

[7]Depowski PL,Rosenthal SI,Ross JS. Loss of expression of the PTENgene protein product is associated with poor outcome in breast cancer[J].Mod Pathol,2001,14(7):672-676.

[8]Kurasawa Y,Shiiba M,Nakamura M,et al.PTEN expression and methylation status in oral squamous cell carcinoma[J].Oncol Rep,2008,19(6):1429-1434.

[9]Storkel S,Reichert T,Reiffen KA,et al. EGFR and PCNA experession in oral squamous cell carcinomas-a valuable tool in estimating the patient''''s prognosis[J].Eur J Cancer Part B:Oral Oncology,1993, 29(4):273-277.

[收稿日期]2012-02-28 [修回日期]2012-04-23

編輯/張惠娟