叢 瑞 佟小非 劉三都 謝 勇 尤 紅

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京友誼醫(yī)院肝病中心，北京 100050;2.貴州省黔南州人民醫(yī)院感染科，貴州 黔南 558000;3.貴州省平塘鎮(zhèn)人民醫(yī)院感染科，貴州 黔南 558300)

近期多項全基因組關聯(lián)分析研究(genome-wide association study，GWAS)發(fā)現(xiàn)白細胞介素28B(interleukin-28B，IL-28B)的基因多態(tài)性(編碼Ⅲ型干擾素IFN-λ3)不僅與丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者對治療的應答有關，還與急性HCV感染者的自發(fā)清除高度相關，這些位點包括rs12979860、rs8099917、 rs10853728、 rs12980275、 rs4803219、rs4803223、rs8105790 等［1-5］。然而在目前的研究中，來自中國人的研究所占比例較少，且這些研究均來自中國臺灣及美國舊金山。所以本研究探討IL-28B基因多態(tài)性與我國HCV感染者自發(fā)清除的關系。

1 對象和方法

1.1 研究對象

本研究共納入122例HCV抗體陽性的丙型肝炎病毒感染者，其中男性59例，女性63例，平均年齡24.4歲。在122例HCV感染者中有10例無法推斷其可能的感染時間。

1.2 診斷標準

根據(jù)2004年頒布的《丙型肝炎防治指南》中規(guī)定:自發(fā)清除者為有輸血史、應用血液制品史或明確的HCV暴露史，經(jīng)檢測HCV抗體陽性，而HCV RNA陰性的HCV感染者;慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)患者為HCV感染超過6個月，或發(fā)病日期不明、無肝炎史，但肝臟組織病理學檢查符合慢性肝炎，或根據(jù)癥狀、體征、實驗室及影像學檢查結果綜合分析，亦可診斷。這些患者均未經(jīng)過干擾素聯(lián)合利巴韋林的抗病毒治療。

1.3 材料與方法

1.3.1 基因組DNA提取及IL-28B基因分型

取患者外周血凝塊0.5 mL，采用離心柱方法(天根DP308提血試劑盒)提取全基因組DNA，按照說明書進行操作。采用紫外分光光度儀(Eppendorf公司，德國)檢測DNA濃度。運用PCR的方法對GWAS研究的候選基因:rs12979860、rs8099917、rs10853728、rs12980275、rs4803219、rs4803223、rs8105790 擴增后用3730測序儀測序并分型(由上海英駿生物技術有限公司完成)。PCR反應條件:95℃預變性10 min;95℃變性30 s，55℃復性30 s，72℃延伸40 s，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。7個位點的引物設計由Pubmed Primer blast設計，由賽百盛公司合成，引物序列見表1。

表1 PCR測序引物Tab.1 Primers for PCR sequencing

1.3.2 HCV病毒定量

HCV定量檢測采用匹基試劑檢測，購自深圳匹基生物工程有限公司，檢測過程嚴格按照說明書進行，檢測下限為1 000拷貝/mL。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計學軟件對結果進行處理，采用χ2檢驗分析不同IL-28B基因型、性別與HCV感染者自發(fā)清除病毒的關系。采用非參數(shù)秩和檢驗比較不同基因型患者病毒定量的關系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 IL-28B基因的7個SNP位點的位置Fig.1 Site of 7 SNPs around IL-28B gene SNP:single nucleotide polymorphism.

2 結果

2.1 入組患者的臨床特點

122例患者中24例(19.7%)患者獲得了自發(fā)清除，98例(80.3%)轉為慢性丙型肝炎。自發(fā)清除組中，男性13例(54.2%)，慢性丙型肝炎組中，男性46例(46.9%)，兩者間性別差異無統(tǒng)計學意義。在明確感染時間的112例感染者中自發(fā)清除組的平均感染年齡為(17.8±14.7)歲，而慢性丙型肝炎組為(28.8±14.6)歲，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P=0.002)，詳見表2。

表2 入組患者臨床特征Tab.2 General data between spontaneous clearance group and non-clearance group n(%)

2.2 IL-28B基因型HCV自發(fā)清除的關系

本研究中7個SNP位點中不同基因型患者間的自發(fā)清除率差異均無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖2 IL-28B基因型與HCV自發(fā)清除的關系Fig.2 IL-28B genotype and HCV spontaneous clearance

rs12979860位點在自發(fā)清除組中CC型22人，CT型為2人，慢性丙型肝炎組中CC型74人，CT型24人。CC基因型與CT基因型2者自發(fā)清除率分別為22.9%(22/96)、7.7%(2/26)，P=0.146;rs8099917位點在自發(fā)清除組中TT型22人，TG型為2人，慢性丙型肝炎組中TT型78人，TG型20人。2種基因型自發(fā)清除率分別為22%(22/100)、9.1%(2/22)，P=0.279;rs12853728位點在自發(fā)清除組中CC型17人，CG型為7人，慢性丙型肝炎組中CC型58人，CG型40人，2種基因型自發(fā)清除率分別為22.7%(17/75)，14.9%(7/47)，P=0.293;rs12980275 位點在自發(fā)清除組中AA型22人，AG型2人，慢性丙型肝炎組中AA型75人，AG型22人。兩種基因型自發(fā)清除率分別為 22.7%(22/97)，8.3%(2/24)，P=0.196。rs4803219位點自發(fā)清除組中CC型22人，CT型2人，慢性丙型肝炎組CC型77人，CT型21人，兩種基因型自發(fā)清除率分別為22.2%(22/43)，8.7%(2/78)，P=0.238;rs4803223位點自發(fā)清除組AA型16人，AG型8人，慢性丙型肝炎組AA型80人，AG型18人，2者自發(fā)清除率分別為16.7%(16/96)，30.8%(8/36)，P=0.109;rs8105790位點自發(fā)清除組TT型22人，TC組2人，慢性丙型肝炎組TT型73人，TC組25人。2種基因型自發(fā)清除率分別為23.2%(22/95)，7.4%(2/27)，P=0.123，詳見表3。

表3 IL-28B基因7個SNP位點與HCV自發(fā)清除Tab.3 7 SNP of IL-28B genotype and HCV spontaneous clearance n(%)

2.3 慢性丙型肝炎組患者的臨床特征

本研究入組的122例患者中，經(jīng)檢測HCV RNA，其中98例患者病毒定量為陽性，成為慢性丙型肝炎患者，病毒水平中位數(shù)為5.58 log IU/mL，具體檢測結果見表4。在98例慢性丙型肝炎患者中，29例(29.6%)患者轉氨酶升高。

表4 慢性丙型肝炎患者臨床特征Tab.4 General data in chronically infected group

2.4 慢性丙型肝炎患者基線HCV RNA水平與IL-28B基因型的關系

檢測慢性丙型肝炎患者未經(jīng)干擾素聯(lián)合利巴韋林治療前的基線病毒水平，采用非參數(shù)秩和檢驗比較rs12979860位點CC及CT型二者病毒載量水平(Z=－2.07，P=0.83);rs8099917位點TT型與TG型比較(Z=－0.366，P=0.715);rs10853728位點CC型與CG型比較(Z=－1.034，P=0.301);rs12980275位點AA型與AG型比較(Z=－1.034，P=0.301);rs4803219位點CC型與CT型比較(Z=－0.697，P=0.486);rs4803223位點AA型與AG型比較(Z=－0.005，P=0.996);rs8105790位點TT型與TC型比較(Z=－1.011，P=0.312)，結果差異均無統(tǒng)計學意義。

3 討論

本研究通過對IL-28B周圍7個SNP位點與HCV感染者自發(fā)清除之間關系的探討，發(fā)現(xiàn)IL-28B基因與我國HCV感染者自發(fā)清除無顯著關聯(lián)性，但患者感染時的年齡卻與HCV感染者能否自發(fā)清除病毒高度相關。來自美國的橫斷面研究［5］顯示:年齡大于20歲的HCV感染者感染后慢性化率為30%，然而小于20歲的HCV感染者為76%。另一個來自意大利的研究［6］也表明:12－25歲的HCV感染者慢性化率為56%，而年齡大于25歲的患者慢性化率則為87%。由此可見，感染時年齡越小，則自發(fā)清除率越高。本研究中自發(fā)清除組患者平均年齡較慢性化組平均年齡低，并且年齡小于20歲較大于20歲感染者自發(fā)清除率高，這些結果進一步證實年齡與HCV清除及疾病進展有關。

此外，對已經(jīng)發(fā)展為慢性丙型肝炎的患者，我們也未發(fā)現(xiàn)IL-28B基因型與病毒載量的高低有關。王東生［7］等研究了我國394例HCV感染者rs12979860位點與HCV自發(fā)清除的關系，其中自發(fā)清除者60例，慢性丙型肝炎患者339例，結果與本研究結果類似，也未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義。究其原因，可能是由于rs12979860在我國人群中T等位基因頻率(本研究中為10%，王東生等［7］研究中為 6%)較歐洲人群(32.6%)［2］低。并且由于IL-28B基因周圍的SNP位點為基因多態(tài)性位點，不如突變位點對疾病的影響顯著。

總之，宿主因素在急性丙型肝炎病毒感染的自發(fā)清除過程中起著十分重要的作用，IL-28B基因多態(tài)性可能預測HCV自發(fā)清除率，然而仍有其他的影響因素需要進一步深入研究，尤其在我國HCV感染人群中尤為重要。

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