趙 暉 王義周 寇 爽 李 明 齊 放 張秋霞 王 蕾*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中藥學(xué)系，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院中醫(yī)學(xué)系，北京 100069;3.泰和誠(chéng)醫(yī)療集團(tuán)醫(yī)學(xué)部，北京 100013)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)自身免疫反應(yīng)介導(dǎo)的炎性神經(jīng)退行性病變［1］。Vogt J等［2］研究發(fā)現(xiàn)，MS的主要病理特征是免疫炎性反應(yīng)引起的脫髓鞘和軸突損傷等，特別是在MS早期就發(fā)生的軸突變性及神經(jīng)元損傷是MS患者神經(jīng)功能障礙的重要原因。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是研究MS公認(rèn)的動(dòng)物模型［3］。選擇堿性髓鞘蛋白(myelin basic protein，MBP)68－86及 MBP87－99均能引起 EAE。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)［4-6］也證實(shí)2種肽段MBP能夠引起大鼠EAE。本研究?jī)?nèi)容則是進(jìn)一步觀察 MBP68－86及 MBP87－99在免疫誘導(dǎo)的EAE大鼠模型中APP及GAP-43 mRNA表達(dá)及其cAMP-PKA的變化，深入探討EAE大鼠發(fā)病過(guò)程中軸突損傷、修復(fù)及其可能的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性Lewis大鼠，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(京)2006－0009。動(dòng)物飼養(yǎng)在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2005－0022，所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品和試劑

不完全福氏佐劑(incomplete freund's adjuvant，IFA)和結(jié)核分支桿菌病(mycobacterium tubercusis，H37Ra，MTB)由美國(guó)Difco公司生產(chǎn)。豚鼠MBP68－86(YGSLPQKSQRSQDENPV)，HPLC＞95%，由北京中科亞光生物科技有限公司合成。CAMP酶免試劑盒由美國(guó)Assay Designs公司生產(chǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR相關(guān)試劑由美國(guó)Takara及Invitrogen公司提供，引物由上海生工生物有限公司合成。DEPC H2O、Trizol試劑，由 Invitrogen公司提供。Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI公司。SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物公司。

1.3 EAE模型的誘導(dǎo)

將大鼠按數(shù)字表法隨機(jī)分成5組，正常組(n=10)、大劑量 MBP68－86模型組(n=17)、中劑量 MBP68－86模型組、小劑量 MBP68－86組模型組(n=17)和 MBP87－99組(n=13)。按不同劑量 MBP68－86(每只分別 75、50、25 μg)和MBP87－99(每只150μg)制備 EAE 模型。各模型組大鼠用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，雙后足墊皮下多點(diǎn)一次性注射200 μL抗原(分別含75、50、25 μg MBP68－86或 150μg MBP87－99、100 μL IFA 及 2 mg結(jié)核桿菌的混合液)免疫誘導(dǎo)大鼠產(chǎn)生EAE。正常組只注射0.9%氯化鈉注射液。

1.4 大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

造模后每天觀察動(dòng)物，發(fā)病后進(jìn)行大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，其評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:未發(fā)病記為0分;鼠尾張力障礙記為1分;步態(tài)不穩(wěn)記為2分;完全后肢癱瘓記為3分;完全肢體癱瘓記為4分;死亡記為5分［7］。

1.5 組織取材與病理學(xué)檢查

大鼠造模后第14天和第28天，用10%水合氯醛10 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠，打開(kāi)胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注0.9%氯化鈉注射液，然后用4%多聚甲醛心內(nèi)灌注固定，取腦組織，常規(guī)處理，石蠟包埋，常規(guī)HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察切片炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.6 各組大鼠腦組織APP、GAP-43及PKA mRNA的變化

取大鼠腦組織50～100 mg，根據(jù)Trizol reagent的說(shuō)明提取總 RNA。提取 RNA溶于 20 μL的 1‰DEPC水，取1 μL稀釋500倍，用核酸蛋白分析儀測(cè)RNA的濃度和純度，取A260/A280在1.9－2.1(蛋白污染指標(biāo))，A260/A230＞2.0(試劑污染指標(biāo))的RNA樣品做下一步實(shí)驗(yàn)，RNA的完整性通過(guò)凝膠電泳來(lái)確定。根據(jù)RT-PCR kit的說(shuō)明合成cDNA(1 μg RNA)。PCR引物采用Gene Bank Accession公布的序列，通過(guò)primer primer 5.0計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。PCR總體系12 μL，其組成為 RNA 樣品量 2 μg，OligoDT 1μL，DEPC水補(bǔ)至12μL。Real time反應(yīng)體系為:REAL SYBR Mixture(2×):10μL，上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各 0.5μL，模板 1.5μL，加入 DEPC 水量至20μL。具體反應(yīng)條件為:APP:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性35 s，54℃退火35 s，每2個(gè)循環(huán)降1℃，72℃延伸60 s，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后，72℃延伸8 min，4℃保存;GAP-43、PKA和β-actin:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸90 s，循環(huán)40次;反應(yīng)結(jié)束后，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物1%的瓊脂糖凝膠(0.5×TBE，每GelRed 0.8 μL 20 mL)電泳，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理后用△△Ct表示。

表1 各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)引物序列Tab.1 Sequences of the primers of measured indicators

1.7 各組大鼠腦組織中cAMP的含量測(cè)定

稱(chēng)取50 mg大鼠腦組織，放入盛有2 mL冷的50 mmol/L，pH 4.75醋酸緩沖液的試管內(nèi)，勻漿，加入2 mL無(wú)水乙醇，混勻，靜止 5 min，3 500 r/min離心15 min，將上清液收集在青霉素小瓶?jī)?nèi)，再用75%乙醇2 mL洗沉淀，勻漿分散，混勻，3 500 r/min離心15 min。合并上清液，60℃烘箱中烘干，殘?jiān)庞?℃保存。測(cè)量時(shí)用1 mL醋酸緩沖液溶解，然后取0.1 mL測(cè)量，用酶免法按照說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定上述樣品中cAMP含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)值均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，均采用單因素方差分析方法，用LSD檢驗(yàn)比較兩組間差異，對(duì)于非正態(tài)分布數(shù)據(jù)選用秩和檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 EAE大鼠神經(jīng)功能評(píng)分

各EAE模型組大鼠在造模第9天陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為體質(zhì)量明顯下降，尾部張力降低，雙后肢無(wú)力，甚至癱瘓。第13天，MBP68－86不同劑量組大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分達(dá)到高峰，分別為3.4、3.1、3.3分，明顯高于MBP87－99組的 2.3 分(P=0.018 和 P=0.004)。而MBP87－99組大鼠發(fā)病緩慢，在第16天達(dá)到高峰，為2.7分(表2)。隨后評(píng)分逐漸下降，病情趨于平穩(wěn)。

表2 EAE大鼠急性期神經(jīng)功能評(píng)分Tab.2 Neurological score of EAE rats at acute stage

2.2 腦組織的病理學(xué)變化

HE染色光鏡下顯示，正常大鼠神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)胞核分明，結(jié)構(gòu)正常(見(jiàn)圖1A)。各EAE模型組大鼠腦組織病理學(xué)改變類(lèi)似，各模型組在急性期均可見(jiàn)小血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)和神經(jīng)細(xì)胞核固縮，灰白質(zhì)均可受累，炎性反應(yīng)以腦室周?chē)鸀橹?。MBP68－86各劑量組所致大鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)較重，有大量的淋巴細(xì)胞聚集在血管周?chē)?，并形成典型的袖套狀改?見(jiàn)圖1B～D)，MBP87－99所致大鼠炎細(xì)胞浸潤(rùn)較輕(見(jiàn)圖1E)。

2.3 各組大鼠腦組織APP、GAP-43 mRNA的表達(dá)

免疫大鼠第14天，各組大鼠腦組織APP mRNA表達(dá)無(wú)明顯變化。第 28天，中劑量 MBP68－86和MBP87－99大鼠 APP mRNA表達(dá)較正常組明顯升高(P=0.028和 0.046)，并且 MBP87－99組較小劑量MBP68－86組升高明顯(P=0.036＜0.05)。免疫后第14天，中劑量MBP68－86組大鼠腦組織 GAP-43 mRNA表達(dá)明顯降低(P=0.042)。第 28天，中劑量MBP68－86和 MBP87－99組的表達(dá)較前升高，與正常組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，MBP87－99組較大劑量 MBP68－86和小劑量MBP68－86升高明顯(P=0.013和0.040)詳見(jiàn)表3。

圖1 各組大鼠急性期腦組織的病理學(xué)改變Fig.1 Pathological changes of rats brain tissues in each group at acute stage(HE，200×)

表3 各組大鼠腦組織APP mRNA、GAP-43 mRNA的表達(dá)Tab.3 mRNA expressions of APP and GAP-43 of rats brain tissues in each group )

表3 各組大鼠腦組織APP mRNA、GAP-43 mRNA的表達(dá)Tab.3 mRNA expressions of APP and GAP-43 of rats brain tissues in each group )

*P ＜0.05 vs normal group;#P ＜0.05 vs high-dose MBP68-86 group;▲P ＜0.05 vs low-dose MBP68-86 group;MBP:myelin basic protein;APP:amyloid precursor protein;GAP:growth-associated protein.

Group___________APP mRNA__The 14th day The 28th day_____________GAP-43 mRNA__The 14th day The 28th day__Normal Group 0.97 ±0.26 0.97 ±0.26 0.91 ±0.23 0.91 ±0.23 High-dose MBP68－86(75 μg) 0.84 ±0.38 1.09 ±0.10 1.09 ±0.30 0.67 ±0.33 Middle-dose MBP68－86(50 μg) 1.02 ±0.39 1.44 ±0.28* 0.79 ±0.11* 1.24 ±0.12 Low-dose MBP68－86(25 μg) 0.58 ±0.11 0.81 ±0.15 0.88 ±0.60 0.89 ±0.05_MBP87－99(150 μg) 0.84 ±0.51 2.38 ±0.89＊▲ 1.13 ±0.52 1.61 ±0.42#▲

2.4 各組大鼠腦組織cAMP/PKA的變化

免疫大鼠后第14天，各組大鼠腦組織cAMP蛋白表達(dá)量及PKA mRNA相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯變化。第28 天，大、小劑量 MBP68－86及 MBP87－99組 cAMP 水平均明顯增高(P=0.008、P=0.049、P=0.010)。中劑量 MBP68－86與 MBP87－99組 PKA mRNA 表達(dá)明顯高于正常組(P=0.017或 P=0.009)，尤其是 MBP87－99組大鼠PKA mRNA表達(dá)還明顯高于大劑量MBP68－86組(P=0.022)，詳見(jiàn)表 4。

3 討論

MBP68－86或 MBP87－99與不完全福氏佐劑及結(jié)核桿菌混勻制成油包水的乳劑皮下注射均可制備Lewis大鼠 EAE 模型。Liu J Q 等［8-9］發(fā)現(xiàn)，MBP68－86是主要的抗原決定簇，而MBP87－99是很小的一個(gè)表位，給予高劑量的MBP87－99才能誘發(fā)EAE病理模型。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也是如此，病理學(xué)發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織有典型的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、脫髓鞘及軸突損傷等改變，但誘導(dǎo)的抗原劑量和EAE病變的程度不同。本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步研究了 MBP68－86及 MBP87－99對(duì) EAE 大鼠軸突損傷、修復(fù)及其可能的分子機(jī)制。

表4 各組大鼠腦組織cAMP、PKA mRNA變化Tab.4 Changes of cAMP and the expression of PKA mRNA of rats brain tissue in each group ()

表4 各組大鼠腦組織cAMP、PKA mRNA變化Tab.4 Changes of cAMP and the expression of PKA mRNA of rats brain tissue in each group ()

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs normal group;#P ＜0.05 vs high-dose MBP68－86 group;PKA:protein kinase;MBP:myelin basic protein.

Group ________cAMP/(pmol·mL －1)____________________The 14th day The 28th day PKA mRNA________________The 14th day The 28th day___Normal Group 28.77 ±12.91 28.77 ±12.91 1.17 ±0.21 1.17 ±0.21 High-dose MBP68－86(75 μg) 39.46 ±8.28 50.42 ±8.17＊＊ 0.86 ±0.91 1.19 ±0.20 Middle-dose MBP68－86(50 μg) 28.87 ±3.38 33.31 ±9.51 1.25 ±0.11 1.64 ±0.11*Low-dose MBP68－86(25 μg) 35.59 ±3.51 43.93 ±10.63* 0.98 ±0.35 1.20 ±0.11_MBP87－99(150 μg)____________________________41.85 ±12.36 49.84 ±3.33＊＊ 1.32 ±0.84 2.07 ±0.42＊＊#

Vogt J等［2］的發(fā)現(xiàn)顯示，在MS和EAE的早期就有廣泛的軸突損害，且在一定程度上與炎性反應(yīng)有關(guān)，隨著病程的進(jìn)展，軸突的損傷逐漸加重，并導(dǎo)致不可逆性神經(jīng)功能障礙。APP是正常神經(jīng)元跨膜糖蛋白，由快速軸突運(yùn)輸轉(zhuǎn)運(yùn)，它的蓄積標(biāo)志著急性活動(dòng)性病灶內(nèi)部及慢性活動(dòng)性病灶邊緣軸突功能障礙及損傷［10］。GAP-43為快速轉(zhuǎn)運(yùn)胞膜磷酸蛋白，只存在于已分化定型并開(kāi)始軸突生長(zhǎng)的神經(jīng)元中，為神經(jīng)損傷和修復(fù)的標(biāo)志物［11］。本次實(shí)驗(yàn)選擇這2個(gè)標(biāo)志性蛋白，從轉(zhuǎn)錄水平上評(píng)價(jià) MBP68－86與 MBP87－99誘導(dǎo)Lewis大鼠腦組織軸突損傷的作用。結(jié)果表明，中劑量MBP68－86免疫大鼠14天后，腦組織GAP-43 mRNA表達(dá)較正常大鼠明顯降低，28天后APP mRNA表達(dá)較正常大鼠顯著提高。中劑量MBP68－86免疫大鼠可導(dǎo)致神經(jīng)元物質(zhì)代謝和蛋白質(zhì)合成能力下降，軸突終末GAP-43 mRNA表達(dá)減少，軸漿運(yùn)輸障礙，免疫反應(yīng)性APP物質(zhì)堆積?？勺鳛樘剿鞫喟l(fā)性硬化軸突損傷的病理特點(diǎn)及藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

MS病變內(nèi)廣泛軸突缺失的確切機(jī)制尚未明確。環(huán)磷酸腺苷(cAMP)是細(xì)胞內(nèi)重要的第2信使，Mizrachi K等［12］研究發(fā)現(xiàn)，EAE大鼠細(xì)胞內(nèi)cAMP水平提高，可抑制EAE大鼠Th1細(xì)胞，并且降低IFN-γ和TNF-α水平，阻止EAE的發(fā)生。cAMP可通過(guò)激活PKA系統(tǒng)促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)或阻止抑制信號(hào)的傳遞［13］。本研究通過(guò)觀察腦組織cAMP含量及PKA mRNA表達(dá)的變化，以了解不同肽段MBP致EAE大鼠腦組織cAMP-PKA信號(hào)途徑的變化。MBP87－99免疫28 d，大鼠腦組織 cAMP與 PKA mRNA均明顯增高，而MBP68－86免疫大鼠腦組織 cAMP含量與 PKA mRNA的表達(dá)水平并不完全對(duì)應(yīng)。中劑量免疫大鼠第28天后，腦組織PKA mRNA表達(dá)雖明顯高于正常組，但cAMP蛋白水平較正常組沒(méi)有明顯變化，而大劑量和小劑量免疫大鼠cAMP蛋白水平明顯增高，但PKA mRNA表達(dá)與正常組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合動(dòng)物發(fā)病情況和病理變化，MBP87－99組大鼠發(fā)病進(jìn)展緩慢、病程長(zhǎng)、神經(jīng)功能評(píng)分較低、病死率低、炎細(xì)胞浸潤(rùn)較輕，而MBP68－86所致EAE模型疾病進(jìn)展較快、動(dòng)物神經(jīng)功能評(píng)分較高，急性期常導(dǎo)致動(dòng)物偏癱乃至部分死亡，炎細(xì)胞浸潤(rùn)較重。MBP87－99免疫大鼠病情較輕，可能通過(guò)上調(diào)cAMP水平，激活PKA轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，促進(jìn)了軸突損傷后的自我修復(fù)。MBP68－86免疫后可能通過(guò)如ATP、腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶活性，影響cAMP含量。深入了解cAMP-PKA信號(hào)途徑促進(jìn)軸突再生以及cAMP-PKA與其他因子或信號(hào)之間的相互影響等問(wèn)題，將為監(jiān)測(cè)MS發(fā)病情況及MS的預(yù)防和治療提供了新的途徑和希望。

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