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        連翹苷對(duì)甲型流感病毒核蛋白基因表達(dá)的影響研究

        2012-04-26 08:39:02段林建王農(nóng)榮何士勤
        中國(guó)全科醫(yī)學(xué) 2012年18期
        關(guān)鍵詞:膠體金連翹流感病毒

        段林建,張 清,王農(nóng)榮,楊 斌,何士勤,孫 堅(jiān)

        甲型流感具有突然暴發(fā)、迅速擴(kuò)散、季節(jié)性流行等特點(diǎn),嚴(yán)重威脅全球人類健康。中草藥為祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶藏,用于治療甲型流感越來(lái)越普遍。連翹 (Forsythia suspensa)為木犀科植物,味苦、無(wú)毒、性微寒,具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效,常用于治療風(fēng)熱感冒[1]。連翹為雙黃連、銀翹散等40余種藥物的重要成分,具有明確的體外抗流感病毒作用[2]。本研究結(jié)合中醫(yī)理論及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù),通過(guò)甲型流感病毒核蛋白 (nucleoprotein,NP)基因的轉(zhuǎn)染,觀察連翹苷對(duì)NP基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)的影響。

        1 材料與方法

        1.1 主要材料 真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NP由本室制備;引物根據(jù) (GenBank/NCB,GI:8486129)毒株的NP基因全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)如下 NP-R1467:CGGGTTCGTTGCCTTTTCGTC、NP-1033:TGGATGGCATGCCACTCTGC;連翹苷 (南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,純度98%);Hela細(xì)胞株由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室饋贈(zèng);DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Opti-MEM培養(yǎng)基 (USA,Gibco);胎牛血清 (USA,Hyclone);感受態(tài)細(xì)菌DH5α由本室制備及保存;質(zhì)粒抽提純化試劑盒 (USA,Genomed);甲型流感病毒NP(膠體金法)檢測(cè)試劑盒 (北京,阿斯可來(lái));LipofectamineTM2000、RNA抽提試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR)試劑盒(USA,invitrogen)等。

        1.2 儀器 二氧化碳 (CO2)培養(yǎng)箱 (USA,Shellab);超低溫冰箱 (JAPAN,SANYO);Ⅱ級(jí)生物安全柜 (北京,東聯(lián)哈爾);潔凈工作臺(tái) (上海,博訊);恒溫恒濕振蕩器 (太倉(cāng),華利達(dá));電子天秤 (北京,賽多利斯);倒置顯微鏡 (JAPAN,Olympus);UV-2450紫外分光光度計(jì) (日本,島津);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (湖南,凱達(dá));移液器 (USA,Glison);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)儀 (美國(guó),伯樂(lè))等。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 實(shí)驗(yàn)藥物制備 電子天平微量稱取連翹苷2 mg溶于10 μl濃度為100%的二甲基亞砜 (DMSO)中,加入9.99 ml無(wú)抗生素的生長(zhǎng)液,配制的連翹苷原液濃度為200μg/ml,DMSO終濃度為1%,充分混勻后用φ0.22μm濾器過(guò)濾6次。

        1.3.2 連翹苷實(shí)驗(yàn)濃度確定 在長(zhǎng)滿Hela細(xì)胞的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加0.25%的胰蛋白酶2 ml,37℃消化約3 min,加等體積含10%胎牛血清的無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)液吹打,離心后計(jì)數(shù),配制成密度為105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液,1 ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h,吸出長(zhǎng)成單層、密度均勻的培養(yǎng)孔內(nèi)廢液,加入PBS洗3次,將連翹苷原液用含1%胎牛血清的維持液進(jìn)行2倍系列稀釋,共設(shè)立10個(gè)稀釋梯度,向每孔內(nèi)加入不同濃度的藥物,相同濃度設(shè)4個(gè)孔,同時(shí)設(shè)4個(gè)陰性細(xì)胞對(duì)照,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng),每日觀察各孔內(nèi)細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。與細(xì)胞對(duì)照組比,未出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變的濃度即為該藥物的無(wú)毒最大界限濃度。將該濃度的下一個(gè)梯度稀釋濃度設(shè)為實(shí)驗(yàn)用濃度。

        1.3.3 質(zhì)粒的培養(yǎng)、提取 將本室構(gòu)建的NP重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒與LB培養(yǎng)基按體積比5∶1 000,在恒溫震搖床上37℃,200 r/min培養(yǎng)15 h,按Genomed質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書抽提NP重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒,并用UV-2450紫外分光光度計(jì)測(cè)其濃度和純度。

        1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組、轉(zhuǎn)染及上清等檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分為NP重組質(zhì)粒組、連翹苷組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組,連翹苷組設(shè)5個(gè)復(fù)孔,余設(shè)3個(gè)復(fù)孔,重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。制備Hela細(xì)胞懸液,密度為2×105個(gè)/ml(不含抗生素的生長(zhǎng)液),以2 ml/孔接種于6孔板中,第2天長(zhǎng)成單層、密度約100%,吸出廢液,用Opti-MEM培養(yǎng)基洗2~3次,吸出廢液。向各實(shí)驗(yàn)組加總體積為2 ml液體,連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組含4μg NP重組質(zhì)粒與10μl LipofectamineTM2000組成的絡(luò)合物;空質(zhì)粒組含4μg空質(zhì)粒與10μl LipofectamineTM2000組成的絡(luò)合物;脂質(zhì)體組內(nèi)含10μl LipofectamineTM2000;Hela細(xì)胞組為生長(zhǎng)液。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)5 h,吸出廢液。連翹苷組加入實(shí)驗(yàn)濃度連翹苷溶液2 ml,NP重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組各加入2 ml不含抗生素的生長(zhǎng)液,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。吸出各孔內(nèi)上清,用甲型流感病毒NP試劑盒 (膠體金法)檢測(cè)。取連翹苷組2個(gè)復(fù)孔的細(xì)胞,分別用1 ml胰酶及1 ml生長(zhǎng)液吹打消化,并用PBS洗2~3次,加入2 ml PBS配成細(xì)胞混懸液,放入-80℃冰箱反復(fù)凍融3次,使細(xì)胞裂解,裂解液用甲型流感病毒NP試劑盒(膠體金法)檢測(cè)。該試劑盒檢測(cè)試紙及膠體金上分別標(biāo)記有抗甲型流感病毒NP、核心抗原單克隆抗體,可以檢測(cè)>5×104TCID50/0.1 ml。陽(yáng)性:在檢測(cè)區(qū)T和對(duì)照區(qū)C各出現(xiàn)一條紅色條帶;陰性:只在對(duì)照區(qū)C位置有一條紅色帶;若檢測(cè)區(qū)T和對(duì)照區(qū)C均未出現(xiàn)條帶,該檢測(cè)試劑無(wú)效。

        1.3.5 RNA的提取、第一鏈cDNA的合成 操作步驟見試劑盒說(shuō)明書,合成后的cDNA稀釋10倍作為RT-PCR模板備用。

        1.3.6 RT-PCR校正曲線及連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達(dá)量 用25μl SYBRMIX,正、反向引物各1μl,2μl拷貝數(shù)為6.11×108/μl的質(zhì)粒,10倍系列梯度稀釋液為模板,21μl無(wú)核酶水,共50μl反應(yīng)體系混合液,在PCR儀上以95℃,10 min;95℃,15 s;60℃,1 min;50℃,14 s;45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增,得出校正曲線。將模板分別換為2μl連翹苷組和NP重組質(zhì)粒組的cDNA,按上述總反應(yīng)體系和條件,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,同一模板濃度做8個(gè)復(fù)孔,且每次均同步做校正曲線。按校正曲線公式計(jì)算連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達(dá)量。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以表示,組間比較采用t檢驗(yàn),以p<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 連翹苷最大無(wú)毒濃度為25μg/ml,實(shí)驗(yàn)濃度為12.5μg/ml。

        2.2 轉(zhuǎn)染后48 h各組甲型流感病毒NP膠體金檢測(cè)結(jié)果 NP重組質(zhì)粒組在檢測(cè)區(qū)T和對(duì)照區(qū)C各出現(xiàn)一條紅色條帶,且檢測(cè)區(qū)紅色條帶顏色較深,說(shuō)明該組甲型流感病毒NP含量高(見圖1A)。空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組只在對(duì)照區(qū)C位置有一條紅色帶,說(shuō)明基本不含甲型流感病毒NP(見圖1B、C、D)。連翹苷組上清只在對(duì)照區(qū)C位置有一條紅色帶,檢測(cè)區(qū)T基本無(wú)紅色條帶,說(shuō)明該組無(wú)或可能含有微量NP(見圖1E)。連翹苷組胞內(nèi)對(duì)照區(qū)C位置有一條紅色帶,檢測(cè)區(qū)T有一紅色條帶,但顏色較對(duì)照區(qū)弱,說(shuō)明該組甲型流感病毒含量不高 (見圖1F)。

        2.3 實(shí)驗(yàn)組RT-PCR校正曲線 RT-PCR校正曲線相關(guān)性為0.998,效率為97.4%,該校正曲線可靠性高 (見圖2)。

        圖2 實(shí)驗(yàn)組RT-PCR校正曲線Figure 2 RT-PCR calibration curve of experimental group

        2.4 轉(zhuǎn)染后48 h連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達(dá)量的比較 重復(fù)4次轉(zhuǎn)染后48 h連翹苷組NP基因表達(dá)量為 (2.1±0.3) ×105拷貝數(shù)/μl,NP重組質(zhì)粒組 NP基因表達(dá)量為(61.5±15.0) ×105拷貝數(shù)/μl,連翹苷組NP基因表達(dá)量低于NP重組質(zhì)粒組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=7.672,p<0.05)。

        3 討論

        甲型流感病毒NP由位于病毒RNA第5片段的NP基因編碼,有型特異性、結(jié)構(gòu)相對(duì)保守等特點(diǎn),常被用于甲型流感的診斷與治療。Miyoshi-Akiyama等[3]發(fā)現(xiàn)膠體金能迅速檢測(cè)甲型流感病毒,且其檢測(cè)帶顏色的深淺不同和病毒的滴度相關(guān),滴度越高顏色越深。Kao等[4]發(fā)現(xiàn)一種新的小分子化合物Nucleozin可以直接引起NP的聚集和抑制核積累。

        中藥連翹有苯乙醇苷類、木脂素類、五環(huán)三萜類、揮發(fā)油等多種成分,各成分作用不一,連翹苷為木脂素類單糖苷的主要成分,具有抗病毒、抑制血小板活化因子活性、抗氧化等作用。本實(shí)驗(yàn)將連翹苷的單體作用于甲型流感病毒NP基因轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞上清與細(xì)胞內(nèi)NP表達(dá)的不同,與徐詠書等[5]研究板藍(lán)根凝集素對(duì)NP表達(dá)現(xiàn)象有相似點(diǎn),上清膠體金測(cè)試為陽(yáng)性,細(xì)胞內(nèi)為弱陽(yáng)性,且本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)連翹苷可以使甲型流感病毒的NP基因拷貝數(shù)降低。本研究認(rèn)為連翹苷可能通過(guò)抑制甲型流感病毒NP與病毒RNA結(jié)合形成NP復(fù)合物,阻礙NP基因復(fù)制,也有可能是抑制NP的轉(zhuǎn)錄水平或NP翻譯后修飾的可能,解決這個(gè)問(wèn)題有待于在今后工作中進(jìn)一步研究。

        1 中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 [S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2010:159-160.

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