段林建，張 清，王農(nóng)榮，楊 斌，何士勤，孫 堅

甲型流感具有突然暴發(fā)、迅速擴散、季節(jié)性流行等特點，嚴(yán)重威脅全球人類健康。中草藥為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的寶藏，用于治療甲型流感越來越普遍。連翹 (Forsythia suspensa)為木犀科植物，味苦、無毒、性微寒，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，常用于治療風(fēng)熱感冒［1］。連翹為雙黃連、銀翹散等40余種藥物的重要成分，具有明確的體外抗流感病毒作用［2］。本研究結(jié)合中醫(yī)理論及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，通過甲型流感病毒核蛋白 (nucleoprotein，NP)基因的轉(zhuǎn)染，觀察連翹苷對NP基因轉(zhuǎn)染后表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 真核質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/NP由本室制備;引物根據(jù) (GenBank/NCB，GI:8486129)毒株的NP基因全長序列設(shè)計如下 NP－R1467:CGGGTTCGTTGCCTTTTCGTC、NP－1033:TGGATGGCATGCCACTCTGC;連翹苷 (南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%);Hela細(xì)胞株由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物教研室饋贈;DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Opti－MEM培養(yǎng)基 (USA，Gibco);胎牛血清 (USA，Hyclone);感受態(tài)細(xì)菌DH5α由本室制備及保存;質(zhì)粒抽提純化試劑盒 (USA，Genomed);甲型流感病毒NP(膠體金法)檢測試劑盒 (北京，阿斯可來);LipofectamineTM2000、RNA抽提試劑盒、第一鏈cDNA合成試劑盒、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT－PCR)試劑盒(USA，invitrogen)等。

1.2 儀器 二氧化碳 (CO2)培養(yǎng)箱 (USA，Shellab);超低溫冰箱 (JAPAN，SANYO);Ⅱ級生物安全柜 (北京，東聯(lián)哈爾);潔凈工作臺 (上海，博訊);恒溫恒濕振蕩器 (太倉，華利達);電子天秤 (北京，賽多利斯);倒置顯微鏡 (JAPAN，Olympus);UV－2450紫外分光光度計 (日本，島津);臺式高速冷凍離心機 (湖南，凱達);移液器 (USA，Glison);聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)儀 (美國，伯樂)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗藥物制備 電子天平微量稱取連翹苷2 mg溶于10 μl濃度為100%的二甲基亞砜 (DMSO)中，加入9.99 ml無抗生素的生長液，配制的連翹苷原液濃度為200μg/ml，DMSO終濃度為1%，充分混勻后用φ0.22μm濾器過濾6次。

1.3.2 連翹苷實驗濃度確定 在長滿Hela細(xì)胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25%的胰蛋白酶2 ml，37℃消化約3 min，加等體積含10%胎牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)液吹打，離心后計數(shù)，配制成密度為105個/ml的細(xì)胞懸液，1 ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h，吸出長成單層、密度均勻的培養(yǎng)孔內(nèi)廢液，加入PBS洗3次，將連翹苷原液用含1%胎牛血清的維持液進行2倍系列稀釋，共設(shè)立10個稀釋梯度，向每孔內(nèi)加入不同濃度的藥物，相同濃度設(shè)4個孔，同時設(shè)4個陰性細(xì)胞對照，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)，每日觀察各孔內(nèi)細(xì)胞病變效應(yīng) (CPE)。與細(xì)胞對照組比，未出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變的濃度即為該藥物的無毒最大界限濃度。將該濃度的下一個梯度稀釋濃度設(shè)為實驗用濃度。

1.3.3 質(zhì)粒的培養(yǎng)、提取 將本室構(gòu)建的NP重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒與LB培養(yǎng)基按體積比5∶1 000，在恒溫震搖床上37℃，200 r/min培養(yǎng)15 h，按Genomed質(zhì)粒提取試劑盒說明書抽提NP重組質(zhì)粒、空質(zhì)粒，并用UV－2450紫外分光光度計測其濃度和純度。

1.3.4 實驗分組、轉(zhuǎn)染及上清等檢測 實驗分為NP重組質(zhì)粒組、連翹苷組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組，連翹苷組設(shè)5個復(fù)孔，余設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)實驗4次。制備Hela細(xì)胞懸液，密度為2×105個/ml(不含抗生素的生長液)，以2 ml/孔接種于6孔板中，第2天長成單層、密度約100%，吸出廢液，用Opti－MEM培養(yǎng)基洗2～3次，吸出廢液。向各實驗組加總體積為2 ml液體，連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組含4μg NP重組質(zhì)粒與10μl LipofectamineTM2000組成的絡(luò)合物;空質(zhì)粒組含4μg空質(zhì)粒與10μl LipofectamineTM2000組成的絡(luò)合物;脂質(zhì)體組內(nèi)含10μl LipofectamineTM2000;Hela細(xì)胞組為生長液。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)5 h，吸出廢液。連翹苷組加入實驗濃度連翹苷溶液2 ml，NP重組質(zhì)粒組、空質(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組各加入2 ml不含抗生素的生長液，37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)48 h。吸出各孔內(nèi)上清，用甲型流感病毒NP試劑盒 (膠體金法)檢測。取連翹苷組2個復(fù)孔的細(xì)胞，分別用1 ml胰酶及1 ml生長液吹打消化，并用PBS洗2～3次，加入2 ml PBS配成細(xì)胞混懸液，放入－80℃冰箱反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞裂解，裂解液用甲型流感病毒NP試劑盒(膠體金法)檢測。該試劑盒檢測試紙及膠體金上分別標(biāo)記有抗甲型流感病毒NP、核心抗原單克隆抗體，可以檢測＞5×104TCID50/0.1 ml。陽性:在檢測區(qū)T和對照區(qū)C各出現(xiàn)一條紅色條帶;陰性:只在對照區(qū)C位置有一條紅色帶;若檢測區(qū)T和對照區(qū)C均未出現(xiàn)條帶，該檢測試劑無效。

1.3.5 RNA的提取、第一鏈cDNA的合成 操作步驟見試劑盒說明書，合成后的cDNA稀釋10倍作為RT－PCR模板備用。

1.3.6 RT－PCR校正曲線及連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達量 用25μl SYBRMIX，正、反向引物各1μl，2μl拷貝數(shù)為6.11×108/μl的質(zhì)粒，10倍系列梯度稀釋液為模板，21μl無核酶水，共50μl反應(yīng)體系混合液，在PCR儀上以95℃，10 min;95℃，15 s;60℃，1 min;50℃，14 s;45個循環(huán)進行擴增，得出校正曲線。將模板分別換為2μl連翹苷組和NP重組質(zhì)粒組的cDNA，按上述總反應(yīng)體系和條件，進行PCR擴增，同一模板濃度做8個復(fù)孔，且每次均同步做校正曲線。按校正曲線公式計算連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連翹苷最大無毒濃度為25μg/ml，實驗濃度為12.5μg/ml。

2.2 轉(zhuǎn)染后48 h各組甲型流感病毒NP膠體金檢測結(jié)果 NP重組質(zhì)粒組在檢測區(qū)T和對照區(qū)C各出現(xiàn)一條紅色條帶，且檢測區(qū)紅色條帶顏色較深，說明該組甲型流感病毒NP含量高(見圖1A)?？召|(zhì)粒組、脂質(zhì)體組、Hela細(xì)胞組只在對照區(qū)C位置有一條紅色帶，說明基本不含甲型流感病毒NP(見圖1B、C、D)。連翹苷組上清只在對照區(qū)C位置有一條紅色帶，檢測區(qū)T基本無紅色條帶，說明該組無或可能含有微量NP(見圖1E)。連翹苷組胞內(nèi)對照區(qū)C位置有一條紅色帶，檢測區(qū)T有一紅色條帶，但顏色較對照區(qū)弱，說明該組甲型流感病毒含量不高 (見圖1F)。

2.3 實驗組RT－PCR校正曲線 RT－PCR校正曲線相關(guān)性為0.998，效率為97.4%，該校正曲線可靠性高 (見圖2)。

圖2 實驗組RT－PCR校正曲線Figure 2 RT－PCR calibration curve of experimental group

2.4 轉(zhuǎn)染后48 h連翹苷組、NP重組質(zhì)粒組NP基因表達量的比較 重復(fù)4次轉(zhuǎn)染后48 h連翹苷組NP基因表達量為 (2.1±0.3) ×105拷貝數(shù)/μl，NP重組質(zhì)粒組 NP基因表達量為(61.5±15.0) ×105拷貝數(shù)/μl，連翹苷組NP基因表達量低于NP重組質(zhì)粒組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=7.672，p＜0.05)。

3 討論

甲型流感病毒NP由位于病毒RNA第5片段的NP基因編碼，有型特異性、結(jié)構(gòu)相對保守等特點，常被用于甲型流感的診斷與治療。Miyoshi－Akiyama等［3］發(fā)現(xiàn)膠體金能迅速檢測甲型流感病毒，且其檢測帶顏色的深淺不同和病毒的滴度相關(guān)，滴度越高顏色越深。Kao等［4］發(fā)現(xiàn)一種新的小分子化合物Nucleozin可以直接引起NP的聚集和抑制核積累。

中藥連翹有苯乙醇苷類、木脂素類、五環(huán)三萜類、揮發(fā)油等多種成分，各成分作用不一，連翹苷為木脂素類單糖苷的主要成分，具有抗病毒、抑制血小板活化因子活性、抗氧化等作用。本實驗將連翹苷的單體作用于甲型流感病毒NP基因轉(zhuǎn)染后的HeLa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞上清與細(xì)胞內(nèi)NP表達的不同，與徐詠書等［5］研究板藍根凝集素對NP表達現(xiàn)象有相似點，上清膠體金測試為陽性，細(xì)胞內(nèi)為弱陽性，且本實驗通過RT－PCR發(fā)現(xiàn)連翹苷可以使甲型流感病毒的NP基因拷貝數(shù)降低。本研究認(rèn)為連翹苷可能通過抑制甲型流感病毒NP與病毒RNA結(jié)合形成NP復(fù)合物，阻礙NP基因復(fù)制，也有可能是抑制NP的轉(zhuǎn)錄水平或NP翻譯后修飾的可能，解決這個問題有待于在今后工作中進一步研究。

1 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典 ［S］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:159－160.

2 Su Wen，Xu Huifu，Huang Hao.Efects of the extract of Forsythia suspensa on influenza A H1N1 infection in vitro ［J］ .J Med Plant Res，2010，4(14):1455－1458.

3 Miyoshi－Akiyama T，Narahara K，Mori S，et al.Development of an immunochromatographic assay specifically detecting pandemic H1N1(2009)influenza virus［J］.Journal of Clinical Microbiology，2010，48(3):703－708.

4 Kao RY，Yang D，Lau LS，et al.Identification of influenza A nucleoprotein as an antiviral target［J］.Nature Biotechnology，2010，28(6):600－605.

5 徐詠書，孫堅，何士勤.三種板藍根制劑對流感病毒核蛋白表達的影響［J］.山東醫(yī)藥，2010，50(27):8－10.