湯 喻，張曉娟，王守俊

糖尿病治療藥物人胰島素通過(guò)激活胰島素受體 (insulin receptor，IR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子 －1受體 (insulin－like growth factor－1 receptor，IGF－1R)及下游信號(hào)通路，發(fā)揮促有絲分裂作用，引發(fā)了人們對(duì)于胰島素及其類(lèi)似物與腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)注［1］。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)人胰島素、長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物甘精胰島素 (insulin glargine，Glargine)能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖［2］。地特胰島素 (insulin detemir，Detemir)是近年來(lái)臨床上常用的一種長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物，去除了人胰島素B30位的氨基酸，并在B29位的賴(lài)氨酸上增加了一個(gè)肉豆蔻酸側(cè)鏈。這種分子結(jié)構(gòu)的變化，使它對(duì)IR、IGF－1R的親和力較人胰島素明顯下降［3］，因此促有絲分裂能力可能弱于其他胰島素。不同類(lèi)型的乳腺癌細(xì)胞中IR、IGF－1R表達(dá)高低不同，胰島素及類(lèi)似物對(duì)其生長(zhǎng)的影響也不同。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究地特胰島素對(duì)雌激素受體 (estrogen receptor，ER) (+)MCF－7細(xì)胞和ER(－)MDA－MB－231細(xì)胞體外作用，比較地特胰島素對(duì)不同類(lèi)型乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用及可能涉及的信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞株購(gòu)于中科院上海生科院細(xì)胞庫(kù)。MTT試劑盒、碘化丙啶 (PI)、蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)、p－Akt(ser473)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(Erk1/2)、p－Erk1/2抗體均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基 (含雙抗)，37℃、5%二氧化碳 (CO2)環(huán)境中生長(zhǎng)。取進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔接種于96孔板，貼壁24 h，行以下處理:(1)1、10、100、1 000 U/L地特胰島素作用48 h; (2)1 U/L地特胰島素作用24、48、72、96 h，以上均設(shè)正常對(duì)照組。每孔加入10μl MTT液，培養(yǎng)4 h。吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入二甲基亞砜 (DMSO)100 μl，震蕩搖勻10 min后，酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)量各孔吸光度值。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁48 h，10 U/L地特胰島素作用24 h，設(shè)立正常對(duì)照組。收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液 (PBS)洗2次，300μl PBS重懸離心后的細(xì)胞沉淀，700μl無(wú)水乙醇逐滴加入，4℃避光過(guò)夜。PBS洗2次，PI染液染色，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.4 Western blot檢測(cè) Erk1/2、Akt磷酸化程度 細(xì)胞以8×104個(gè)/孔接種于6孔板，貼壁48 h，10 U/L地特胰島素作用24 h，設(shè)立正常對(duì)照組。提取蛋白，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度，將蛋白濃度調(diào)至4 g/L，與5×上樣緩沖液混合，沸水煮10 min，冷卻后25μl上樣，10%SDS－PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉2 h，一抗4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜3次后加二抗孵育1 h。洗膜3次后DAB顯色。Vision－WorkLS軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用表示，重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組數(shù)據(jù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或Mann－Whitney檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度地特胰島素對(duì)MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞生長(zhǎng)影響 培養(yǎng)48 h后，地特胰島素1、10、100、1 000 U/L均引起MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組有所增多，但不同濃度的增多值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F值分別為1.418 和 2.568，P 值分別為 0.246 和 0.125，見(jiàn)圖 1、2)。

圖1 不同濃度地特胰島素對(duì)MCF－7細(xì)胞生長(zhǎng)影響 (n=12)Figure 1 Effect of Detemir on proliferation of MCF－7 cells with different concentration

表1 地特胰島素作用MCF－7細(xì)胞后的細(xì)胞周期結(jié)果 (，%)Table 1 Cell cycle of MCF－7 cells after treated with Detemir

表1 地特胰島素作用MCF－7細(xì)胞后的細(xì)胞周期結(jié)果 (，%)Table 1 Cell cycle of MCF－7 cells after treated with Detemir

/M正常對(duì)照組 3 72.68 ±5.59 2.89 ±3.06 24.43 ±8.04 27.32 ±5.60組別 例數(shù) G0/G1 G2/M S S+G2地特胰島素組 3 65.94 ±6.67 2.27 ±2.29 31.80 ±5.07 34.07 ±6.68

圖2 不同濃度地特胰島素對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞生長(zhǎng)影響 (n=12)Figure 2 Effect of Detemir on proliferation of MDA－MB－231 cells with different concentration

2.2 不同作用時(shí)間的地特胰島素對(duì)MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞生長(zhǎng)影響 1 U/L地特胰島素作用24 h，MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組有所減少，1 U/L地特胰島素作用48、72、96 h引起細(xì)胞數(shù)目較正常對(duì)照組有所增多，但不同作用時(shí)間減少或增多的差值間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F 值分別為 0.488 和 4.585，P 值分別為 0.501 和 0.058，見(jiàn)圖3、4)。

表2 地特胰島素作用MDA－MB－231細(xì)胞后的細(xì)胞周期結(jié)果(，%)Table2 Cell cycle of MDA－MB－231 cells after treated with Detemir

表2 地特胰島素作用MDA－MB－231細(xì)胞后的細(xì)胞周期結(jié)果(，%)Table2 Cell cycle of MDA－MB－231 cells after treated with Detemir

組別 例數(shù) G0/G1 G2/M S S+G2 3 52.14 ±1.54 8.16 ±3.34 4.24 ±1.90 47.86 ±1.54地特胰島素組 3 43.16 ±5.59 4.24 ±1.90 52.60 ±7.47 56.84 ±5.59/M正常對(duì)照組

表3 地特胰島素作用MCF－7細(xì)胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(，%)Table 3 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MCF－7 cells after treated with Detemir

表3 地特胰島素作用MCF－7細(xì)胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較(，%)Table 3 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MCF－7 cells after treated with Detemir

組別 例數(shù)3 41.26 ±11.23 47.78 ±1.09地特胰島素組 3 54.27 ±10.06 50.29 ±1.43 t p－Erk1/2/Erk1/2 p－Akt/Akt正常對(duì)照組0.353 0.466 P值值0.218 0.073

圖3 不同作用時(shí)間的地特胰島素對(duì)MCF－7細(xì)胞生長(zhǎng)影響 (n=12)Figure 3 Effect of Detemir on proliferation of MCF－7 cells at different time

圖5 地特胰島素作用后MCF－7細(xì)胞中Erk1/2、p－Erk1/2、Akt、p－Akt的表達(dá)Figure 5 The expression of Erk1/2，p－Erk1/2，Akt，p－Akt in MCF－7 cells after treated with Detemir

圖4 不同作用時(shí)間的地特胰島素對(duì)MDA－MB－231細(xì)胞生長(zhǎng)影響(n=12)Figure4 Effect of Detemir on proliferation of MDA －MB －231 cells at different time

2.3 細(xì)胞周期變化 10 U/L地特胰島素作用MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞24 h，細(xì)胞周期變化較正常對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值分別為0.400和0.100，見(jiàn)表1、2)。

2.4 Erk1/2和Akt磷酸化程度 10 U/L地特胰島素作用MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞24 h，Erk1/2和Akt磷酸化程度與正常對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05，見(jiàn)圖5、6，表3、4)。

圖6 地特胰島素作用后MDA－MB－231細(xì)胞中Erk1/2、p－Erk1/2、Akt、p－Akt的表達(dá)Figure 6 Expression of Erk1/2，p－Erk1/2，Akt and p－Akt of MDAMB－231 cells after treated with Detemir

3 討論

2型糖尿病、糖尿病治療藥物與腫瘤的關(guān)系是當(dāng)今內(nèi)分泌領(lǐng)域的熱點(diǎn)。2型糖尿病患者腫瘤發(fā)病率增加，主要與胰島素抵抗和高胰島素血癥有關(guān)，同時(shí)有雌激素等的參與［4］。高胰島素使體內(nèi)游離的有生物活性的 IGF－1增多［5］，胰島素、IGF－1激活I(lǐng)R、IGF－1R及下游信號(hào)通路，共同在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮作用。同時(shí)一些研究顯示人胰島素［6］、甘精胰島素［7］、二甲雙胍［8］、吡格列酮［9］等糖尿病治療藥物通過(guò)調(diào)節(jié)IR、IGF－1R下游絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK)和 (或)磷脂酞酰肌醇－3－激酶 (PI3K)/Akt信號(hào)通路影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

表4 地特胰島素作用MDA－MB－231細(xì)胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較 (，%)Table 4 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MDA－MB－231 cells after treated with Detemir

表4 地特胰島素作用MDA－MB－231細(xì)胞后Erk1/2和Akt磷酸化程度比較 (，%)Table 4 Phosphorylation of Erk1/2 and Akt of MDA－MB－231 cells after treated with Detemir

組別 例數(shù)3 53.54 ±1.60 55.65 ±1.67地特胰島素組 3 60.77 ±6.70 58.49 ±0.88 t p－Erk1/2/Erk1/2 p－Akt/Akt正常對(duì)照組0.114 0.384 P值值0.156 0.060

人工合成的胰島素及類(lèi)似物是2型糖尿病治療的重要方法。根據(jù)人體生理胰島素分泌方式，將治療糖尿病的胰島素及類(lèi)似物分為餐時(shí)胰島素和基礎(chǔ)胰島素，后者又包括中效和長(zhǎng)效兩類(lèi)。目前臨床上使用的長(zhǎng)效胰島素類(lèi)似物有甘精胰島素和地特胰島素，它們成功模擬了人體基礎(chǔ)胰島素的分泌，有效控制空腹血糖的同時(shí)降低了餐前和夜間低血糖的發(fā)生。地特胰島素在分子結(jié)構(gòu)上去除了人胰島素B30位的氨基酸，并在B29位的賴(lài)氨酸上增加了一個(gè)肉豆蔻酸側(cè)鏈，使得它對(duì)IR、IGF－1R的親和力較人胰島素、甘精胰島素明顯降低。因此推測(cè)地特胰島素促有絲分裂的能力可能弱于其他胰島素及類(lèi)似物。最近的流行病學(xué)調(diào)查顯示使用地特胰島素者2型糖尿病腫瘤風(fēng)險(xiǎn)比使用甘精胰島素者降低或相當(dāng)［10］。

不同類(lèi)型的乳腺癌細(xì)胞中IR、IGF－1R表達(dá)高低不同。IGF－1R在ER(+)的乳腺癌MCF－7細(xì)胞中表達(dá)較高，而在ER(－)的乳腺癌MDA－MB－231細(xì)胞中表達(dá)很低［11］。乳腺癌細(xì)胞中IGF－1R表達(dá)的不同，使得胰島素對(duì)其生長(zhǎng)的影響也不同。Mayer等［12］對(duì)不同類(lèi)型乳腺癌細(xì)胞株用結(jié)晶紫方法研究細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)只有在IR/IGF－1R高表達(dá)的MCF7及其衍生細(xì)胞株MELN對(duì)胰島素和IGF－1有增殖反應(yīng)。

本實(shí)驗(yàn)中使用了乳腺癌MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞兩種雌激素受體不同的細(xì)胞。地特胰島素以不同濃度和作用時(shí)間作用兩種細(xì)胞。地特胰島素分別以1、10、100、1 000 U/L作用48 h，促進(jìn)兩種細(xì)胞增殖，但差異不明顯;地特胰島素1 U/L作用24 h，兩種細(xì)胞數(shù)目減少，作用時(shí)間延長(zhǎng)至48、72、96 h時(shí)，兩種細(xì)胞數(shù)目增多，但差異不明顯，無(wú)法說(shuō)明地特胰島素對(duì)兩種細(xì)胞是否具有促進(jìn)或抑制增殖的作用。地特胰島素10 U/L作用24 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期變化較正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。接著對(duì)Erk1/2、Akt磷酸化程度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞中地特胰島素組Erk1/2、Akt磷酸化程度較正常對(duì)照亦無(wú)明顯差異，說(shuō)明IR、IGF－1R下游的MAPK、PI3K/Akt信號(hào)通路未見(jiàn)表達(dá)上調(diào)。

研究證實(shí)人胰島素、甘精胰島素通過(guò)上調(diào)IR、IGF－1R及其下游MAPK、PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，地特胰島素與IR、IGF－1R的親和力較低，因此推測(cè)地特胰島素促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用較弱。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)地特胰島素對(duì)MCF－7和MDA－MB－231細(xì)胞均無(wú)明顯的促增殖作用，同時(shí)Erk1/2和Akt的磷酸化程度無(wú)明顯升高，地特胰島素并未引起MAPK、PI3K/Akt信號(hào)通路的高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)在一定程度上論證了地特胰島素臨床使用的安全性。但由于本實(shí)驗(yàn)為體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，腫瘤細(xì)胞系長(zhǎng)期培養(yǎng)在低氧條件下，其對(duì)胰島素的依賴(lài)性與體內(nèi)存在著差別。因此，需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)即動(dòng)物模型進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，今后有必要建立動(dòng)物模型，進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

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