鄧永花，賴前成，萬(wàn)居易，伍長(zhǎng)學(xué)，王 波，廖 斌

烏司他丁是一種廣譜酶抑制劑，能夠抑制炎性遞質(zhì)釋放及對(duì)缺血再灌注器官具有保護(hù)作用［1］。體外循環(huán)是目前心臟外科心內(nèi)直視手術(shù)不可避免的復(fù)雜的病理生理過(guò)程，復(fù)雜的管道系統(tǒng)、體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間、灌注流量和壓力、灌流模式等多種因素可導(dǎo)致患者術(shù)后發(fā)生腎功能損傷［2］。目前較少直接觀察烏司他丁對(duì)體外循環(huán)缺血再灌注血清對(duì)人腎小管細(xì)胞損傷作用的保護(hù)。為此，本研究初步觀察了體外循環(huán)后血清直接對(duì)人近曲腎小管上皮細(xì)胞HK－2損傷的作用，旨在探討烏司他丁對(duì)腎功能保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人HK－2引自ATCC(American Type Culture Collection);DMEM(GIBCO);胰酶 (OXODI);胎牛血清 (成都哈里公司);Annexin V－FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋公司);SP9000免疫組化染色試劑盒 (北京中杉金橋公司);多聚賴氨酸，DAB顯色試劑盒 (武漢博士德公司);烏司他丁 (廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn));其余試劑均為市售分析純。

1.2 方法

1.2.1 HK－2細(xì)胞株的復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代 從液氮罐中取出凍存的HK－2細(xì)胞投入37℃的溫水中，搖動(dòng)使其盡快解凍。吸出細(xì)胞懸液并滴加10倍體積的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液后再重復(fù)洗滌1次。用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細(xì)胞懸液稀釋混勻，接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，37℃下5%二氧化碳 (CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置12 h，換液除去未貼壁細(xì)胞后至細(xì)胞長(zhǎng)滿成片80%以上。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化，傳代。

1.2.2 正常人、體外循環(huán)再灌注血清的制備 隨機(jī)采集6例健康志愿者的外周血5 ml，立即在4℃離心機(jī)1 500 r/min離心15 min收集上清，－20℃保存?zhèn)溆?。隨機(jī)選取我科體外循環(huán)手術(shù)主動(dòng)脈阻斷時(shí)間在60 min以上的心臟手術(shù)患者12例，于開(kāi)放主動(dòng)脈1 h后采集外周血5 ml，立即在4℃離心機(jī)1 500 r/min離心15 min收集上清，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 腎小管上皮細(xì)胞缺血再灌注模型的建立 (1)培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的缺血模擬:100%N2飽和無(wú)糖無(wú)機(jī)鹽緩沖液40 min，吸棄6孔板及培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基，用無(wú)糖無(wú)機(jī)鹽緩沖液沖洗，加入100%N2飽和無(wú)糖無(wú)機(jī)鹽緩沖液，置95%N2+5%CO2環(huán)境培養(yǎng)2 h。(2)培養(yǎng)腎小管上皮細(xì)胞的再灌注模擬及分組:吸棄6孔板及培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)無(wú)糖無(wú)機(jī)鹽緩沖液沖液后，空白組不含血清;對(duì)照組以正常人血清代替再灌注血清;試驗(yàn)組加入含10%體外循環(huán)再灌注血清的DMEM低糖培養(yǎng)基，置95%O2+5%CO2環(huán)境培養(yǎng)4 h;烏司他丁組以改良的缺血再灌注方式處理腎小管上皮細(xì)胞的過(guò)程中，施加烏司他丁干預(yù)。處理后的6孔板內(nèi)的腎小管上皮細(xì)胞用于免疫細(xì)胞化學(xué)法(ICC)檢測(cè)。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的腎小管上皮細(xì)胞消化離心洗滌后采用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)分析 胰酶消化細(xì)胞，PBS清洗2次，加入適量的熒光標(biāo)記的annexin V試劑和碘化丙啶 (PI)，混勻后避光室溫下孵育15 min，孵育后加入400μl染色緩沖液，立即上流式細(xì)胞儀分析并記錄結(jié)果。

1.2.5 caspase－3蛋白表達(dá)檢測(cè) 按試劑盒說(shuō)明書操作采用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白 (Streptavidin/Peroxidase，SP)染色的免疫組化檢測(cè)caspase－3蛋白表達(dá)。圖像分析采用Image－Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)積分分光光度值 (IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以()表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，體外循環(huán)血清處理后，4組腎小管上皮細(xì)胞HK－2凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05);其中試驗(yàn)組較空白組、對(duì)照組、烏司他丁組均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為17.85、18.98和29.64，P=0.00);空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=0.34，P=0.39);烏司他丁組與空白組、對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為0.59和0.56，P值分別為0.31和0.36，見(jiàn)表1)。

2.2 caspase－3蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色 4組caspase－3蛋白IOD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (p＜0.05);其中試驗(yàn)組較空白組、對(duì)照組、烏司他丁組均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為32.44、31.72和27.68，P=0.00);空白組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q=1.10，P=0.27);烏司他丁組與空白組、對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值分別為1.50和1.60，P=0.22和0.25，見(jiàn)圖1、表2)。

表1 4組腎小管上皮細(xì)胞HK－2凋亡率比較 (x ±s，%)Table 1 Comparison of apoptosis rate of HK－2 cells in four groups

圖1 caspase－3蛋白免疫細(xì)胞化學(xué) (IHC)染色Figure 1 IHC staining of caspase－3 protein

表2 4組caspase－3蛋白IOD值比較Table 2 Comparison of IOD in four groups

3 討論

烏司他丁是從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α－糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶具有抑制作用［3］，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)其具有穩(wěn)定溶酶體膜，抑制溶酶體酶的釋放，抑制心肌抑制因子 (MDF)產(chǎn)生，清除氧自由基及抑制腫瘤壞死因子－α(TNF－α)等炎性遞質(zhì)釋放的作用［4－5］。體外循環(huán)心臟手術(shù)后急性腎衰竭(AKI)的發(fā)生率為20% ～30%，其腎損害輕重不一［6］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外循環(huán)并發(fā)AKI主要原因是導(dǎo)致腎小管損傷［7］，其致病因素較復(fù)雜，包括缺血再灌注損傷及全身炎性遞質(zhì)，常是綜合性因素所致［8］。

本研究體外培養(yǎng)HK－2細(xì)胞，用體外循環(huán)手術(shù)主動(dòng)脈阻斷時(shí)間在60 min以上的患者，于開(kāi)放主動(dòng)脈1 h后血清，真實(shí)全面地模擬手術(shù)后體內(nèi)各個(gè)器官，多種因素參與的致病因子［9］。同時(shí)應(yīng)用缺氧復(fù)氧模擬體內(nèi)阻斷時(shí)的缺血再灌注損傷。結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組與空白組明顯增加，而給予烏司他丁培養(yǎng)后凋亡率明顯下降。

caspase－3是凋亡執(zhí)行的重要效應(yīng)分子，是凋亡發(fā)生的關(guān)鍵效應(yīng)酶。其表達(dá)的增加、激活是凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是凋亡啟動(dòng)過(guò)程中的早期事件，是參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶之一［10－11］。烏司他丁組較試驗(yàn)組能明顯降低caspase－3表達(dá)，提示其可能抑制細(xì)胞內(nèi)依賴caspase的凋亡途徑，從而保護(hù)腎小管細(xì)胞。但仍需進(jìn)一步觀察其對(duì)整體腎功能保護(hù)作用。

綜上所述，心臟手術(shù)體外循環(huán)后血清通過(guò)多種因素導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而烏司他丁能廣泛抑制多種炎性遞質(zhì)對(duì)HK－2細(xì)胞的損傷作用，其機(jī)制可能與抑制caspase－3表達(dá)減少細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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