孟俊龍，馮翠萍，常明昌，程紅艷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，山西 太谷030801）

香菇［Lentinus edodes（Berk.）Sing］在分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科香菇屬，是世界著名的食用兼藥用菌之一，香菇中含有一種分子量為100萬(wàn)的香菇多糖［1］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，香菇中的香菇多糖能治療癌病，能夠刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)使機(jī)體的免疫功能得到恢復(fù)和提高，由機(jī)體本身的抵抗力去殺死腫瘤細(xì)胞；香菇多糖還可改善肌體代謝，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)多種細(xì)菌、寄生蟲、病毒性感染（包括艾滋病）的免疫能力；香菇多糖及其培養(yǎng)液還有護(hù)肝并增強(qiáng)肝排毒能力，降低血清轉(zhuǎn)氨酶水平的作用；香菇多糖能提高SOD活性和降低脂褐素含量；香菇多糖有抑制血小板聚集作用，還有一定的抗疲勞作用［2～5］。

本試驗(yàn)用分光光度法來(lái)探討香菇多糖對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmonella）的抑制作用，旨在為真菌多糖的抑菌性研究提供思路和方法，同時(shí)也為香菇多糖作為抑菌成分的開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

香菇多糖參照文獻(xiàn)［6］水提醇沉法提取，葡聚糖G－100純化。

1.1.2 供試菌種

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、沙門氏菌（Salmomella）均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品質(zhì)量與安全實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 試劑

乙醇、無(wú)水乙醚、丙酮、檸檬酸、氯化鈉、氫氧化鈉、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、牛肉膏、蛋白胨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（北京玻聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）、離心機(jī)（上海安享科學(xué)儀器廠）、2100型分光光度計(jì)（UNICO）、隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械處）、全溫震蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新高醫(yī)療器械制造有限公司）、超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備處）、高壓滅菌鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備處）、旋渦混合器（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 固體培養(yǎng)基的配制

稱取4.5g營(yíng)養(yǎng)瓊脂加入到100mL蒸餾水中，在三角瓶中加熱待完全融化后，121℃，15min高壓滅菌，備用。

1.2.2 液體培養(yǎng)基的配制

稱取牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、氯化鈉0.5g加入到100mL蒸餾水中，加熱待完全溶解后，調(diào)pH于7.2，分裝于三角瓶中，121℃，15min高壓滅菌，備用。

1.2.3 無(wú)菌生理鹽水的配制

準(zhǔn)確稱取9g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121℃，15min高壓滅菌，備用。

1.2.4 菌懸液的制備

在無(wú)菌條件下，用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上1～2個(gè)大小適宜的菌落于液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)24h即可得一定濃度的菌懸液，用無(wú)菌生理鹽水稀釋菌懸液，使其吸光值分布在0.6～0.8之間，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 香菇多糖對(duì)四種菌的抑制作用

1.2.5.1 不同時(shí)間香菇多糖對(duì)四種菌的抑制作用的影響

在無(wú)菌條件下，分別取上述菌懸液9mL，并添加1g·L－1的香菇多糖液200μL，用旋渦混勻器混勻后，在37.5℃搖床培養(yǎng)，并以不加香菇多糖液的作為對(duì)照，以蒸餾水作為空白。每隔12h測(cè)定一次吸光度值A(chǔ)，共測(cè)定4次。重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算其抑菌率，確定最適作用時(shí)間。

1.2.5.2 不同pH香菇多糖對(duì)四種菌的抑制作用的影響

在無(wú)菌條件下，分別取上述菌懸液9mL，并添加1g·L－1的香菇多糖液200μL，并用0.1mol·L－1檸檬酸和2.0%的NaOH溶液分別調(diào)整其pH為5、6、7、8、9，用旋渦混合器混勻后，在37.5℃搖床培養(yǎng)24h，以不加香菇多糖液的作為對(duì)照，以蒸餾水作為空白。測(cè)其吸光度值A(chǔ)，重復(fù)3次，取平均值，計(jì)算出抑菌率，確定最適作用的pH。

1.2.5.3 不同濃度香菇多糖對(duì)四種菌的抑制作用的影響

在上述最適條件下，用2倍稀釋法將香菇多糖液的濃度稀釋成1g·L－1，0.5g·L－1，0.25g·L－1，0.125g·L－1，0.0625g·L－15個(gè)濃度梯度。在無(wú)菌條件下，分別取上述菌懸液9mL，并添加不同濃度的香菇多糖液200μL，用旋渦混合器混勻，在37.5℃搖床培養(yǎng)24h，以不加香菇多糖液的作為對(duì)照，以蒸餾水作為空白。測(cè)其吸光度值，重復(fù)3次，取平均值，并計(jì)算出抑菌率［7］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)間香菇多糖對(duì)四種菌抑制率的影響

由圖1可見(jiàn)，時(shí)間對(duì)香菇多糖抑制4種菌有一定的影響。對(duì)沙門氏菌的抑制作用在24h時(shí)達(dá)到最大，對(duì)其它3種菌均在12h時(shí)達(dá)到最大。其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制可達(dá)到100%。

2.2 不同pH值香菇多糖對(duì)四種菌抑制率的影響

由圖2可見(jiàn)，不同的pH下，香菇多糖對(duì)4種菌的抑制作用不同。對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用在pH為6時(shí)最大；對(duì)其它菌的抑制作用均在pH為5時(shí)最大。

圖1 不同時(shí)間香菇多糖對(duì)四種菌抑菌率的影響Fig.1 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different time

圖2 不同pH香菇多糖對(duì)四種菌抑菌率的影響Fig.2 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different pH

2.3 不同濃度香菇多糖對(duì)四種菌抑制率的影響

根據(jù)2.1和2.2確定的最佳抑菌條件進(jìn)行不同濃度的香菇多糖對(duì)4種菌的抑菌作用的研究，結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著濃度的降低，香菇多糖對(duì)4種菌的抑制率均逐漸減小，且香菇多糖對(duì)4種菌的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌，當(dāng)濃度達(dá)1g·L－1L時(shí)，抑制率分別達(dá)100%、100%、68.7%、44.1%。

3 討論

3.1 分光光度法測(cè)定抑菌率

圖3 不同濃度香菇多糖對(duì)四種菌抑菌率的影響Fig.3 Ganoderm Lucidumpolysaccharide inhibition rate on four bacteria in different concentration

分光光度法是測(cè)定抑菌作用常用的一種方法，該方法可避免牛津杯法在抑菌物濃度高時(shí)滲出效果差，以及紙片法吸收液體少等缺點(diǎn)。分光光度法測(cè)定抑菌率時(shí)由于菌懸液及多糖本身具有一定的吸光值，因此，在計(jì)算抑菌率時(shí)要消除菌懸液和多糖本身的吸光值。

3.2 時(shí)間對(duì)香菇多糖抑菌作用的影響

香菇多糖對(duì)4種供試菌種在12或24h達(dá)到最大抑菌作用，24h后香菇多糖的抑菌作用有所減弱，其原因可能是香菇多糖對(duì)細(xì)菌既有一定的抑制作用，也可為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)，這與細(xì)菌種類和數(shù)量有關(guān)，前期以抑制作用占主導(dǎo)，而24h后以作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供細(xì)菌生長(zhǎng)為主導(dǎo)。

3.3 pH對(duì)香菇多糖抑菌作用的影響

香菇多糖對(duì)4種供試菌種都在酸性條件下達(dá)到最大抑菌作用，在堿性條件下抑制作用小。其結(jié)果可能由于酸性條件下有助于多糖液作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞構(gòu)成細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)，破壞細(xì)胞膜的超分子結(jié)構(gòu)而造成細(xì)胞內(nèi)成分流失，導(dǎo)致菌體死亡［8］。細(xì)菌的最適生長(zhǎng)pH 為6.5～7.5，在堿性條件時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)速度快，堿性環(huán)境更適于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，香菇多糖的濃度低對(duì)其的抑制作用小。

3.4 香菇多糖的抑菌作用

多糖對(duì)各類微生物的生長(zhǎng)有程度不同的抑制活性，或者說(shuō)生長(zhǎng)拮抗，但多糖抑菌作用的機(jī)制還不十分明確［9］。本試驗(yàn)中香菇多糖的抑菌作用機(jī)制，可能是［10］：（1）一定濃度的多糖作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞了細(xì)菌細(xì)胞膜的超分子結(jié)構(gòu)而造成細(xì)胞內(nèi)成分流失，導(dǎo)致菌體死亡。（2）由于微生物細(xì)胞壁上存在能與糖專一結(jié)合的糖基、蛋白，它能使多糖高度聚集于菌體的表面，改變菌細(xì)胞的代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖被抑制，甚至死亡。（3）在多糖存在的情況下，細(xì)菌的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等細(xì)胞壁降解酶活性被激發(fā)出來(lái)，導(dǎo)致對(duì)其自身細(xì)胞壁的破壞，外部物質(zhì)滲進(jìn)細(xì)胞內(nèi)，破壞了菌細(xì)胞的完整性，菌體死亡。

4 結(jié)論

香菇多糖對(duì)4種供試菌種都有一定的抑制作用，對(duì)沙門氏菌的抑制作用在24h時(shí)達(dá)到最大，對(duì)其它3種菌均在12h時(shí)達(dá)到最大。在酸性條件下抑菌作用比堿性條件下都強(qiáng)。不同濃度的香菇多糖提取液對(duì)4種供試菌的抑制作用不同，且隨著濃度的增加而增加。對(duì)4種菌的抑制作用由強(qiáng)到弱依次為金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌。

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