談靜惠，高瑩，程超，李宏，王美琴，郝曉娟

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太谷030801）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）作為應(yīng)用較廣的生防微生物，具有與環(huán)境兼容性好、抗菌活性高、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)［1］?？莶菅挎邨U菌制劑的穩(wěn)定性、與化學(xué)農(nóng)藥的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性方面均優(yōu)于不產(chǎn)芽孢的細(xì)菌和真菌生防菌株。其生防作用和生防機(jī)理一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［2～7］。研究表明，該菌的生防機(jī)理包括競爭作用、拮抗作用、誘導(dǎo)植物抗性等，尤以拮抗作用為最主要的防病機(jī)理［8］。

枯草芽孢桿菌D－29菌株是本課題組從地膚中獲得的一株具有生防潛力的內(nèi)生細(xì)菌［9］，本研究對該菌株的抑菌譜和抑菌物質(zhì)特性進(jìn)行了分析，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌種及培養(yǎng)基

枯草芽孢桿菌D－29菌株和棉花立枯病菌（Rhizoctonia solani）、玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、辣椒枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum）、茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.melongenae）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、梨樹腐爛病菌（Valsa mali）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp niveum）、玉米穗腐病菌（Fusarium graminearum）、黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumerinum）、蘋果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等菌株均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。供試真菌菌株的培養(yǎng)及平板對峙試驗(yàn)使用馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），內(nèi)生細(xì)菌D－29的培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）［10］。

1.2 D－29對供試病原菌的拮抗作用

平板對峙法［11］測定D－29對供試病原真菌拮抗作用。

抑制率／%＝［（對照真菌菌落直徑－處理真菌菌落直徑）／（對照真菌菌落直徑－6）］×100%。

菌落直徑＝（水平直徑＋垂直直徑）／2

1.3 D－29菌株抑菌蛋白提取與抑菌活性測定

將斜面活化的枯草芽孢桿菌D－29菌株接種到裝有150mL NB培養(yǎng)液的250mL三角瓶中，在170r·min－1，28 ℃培養(yǎng)48h。4 ℃，10000r·min－1離心10min，收集上清液。用不同飽和度的硫酸銨分級鹽析，4℃下沉淀12h后，4℃、10000r·min－1離心10min，取上清備用，沉淀用少量體積20mmol·L－1的 Tris－Hcl緩沖液（pH 6.8）溶解，用同種緩沖液透析去鹽即得到抑菌蛋白粗提液。平板擴(kuò)散法測定抑菌活性［12］。

1.4 D－29蛋白粗提液的穩(wěn)定性測定［13］

熱穩(wěn)定性：將蛋白粗提液分別在50℃處理60 min、80℃ 處理30min和60min、100℃處理30 min和60min。

pH穩(wěn)定性：將蛋白粗提液用鹽酸和氫氧化鈉分別 調(diào) 至 pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，4 ℃靜置過夜，用鹽酸和氫氧化鈉將各pH值調(diào)回中性后檢測活性。

對有機(jī)溶劑的敏感性：在蛋白粗提液中分別加入等體積的乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮和甲醇，充分混勻，30min后，熱水浴（約50℃）去除有機(jī)溶劑檢測活性。

紫外照射穩(wěn)定性：將蛋白粗提液在20W紫外燈下距離10cm 分別照射0、2、4、6、8、10、12h后檢測活性。

平板擴(kuò)散法測定活性，每孔加處理過的蛋白粗提液40μL，以未處理的粗蛋白作對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 D－29對供試病原菌的拮抗作用測定結(jié)果

由表1可以看出，D－29對11種供試病原菌均有抑制作用，具有廣譜抑菌活性。D－29對西瓜枯萎病菌及黃瓜枯萎病菌表現(xiàn)出較強(qiáng)的拮抗作用，抑菌率分別為31.6%和31.3%；對玉米大斑病菌拮抗作用最強(qiáng)烈，抑菌率高達(dá)54.6%。

表1 枯草芽孢桿菌D－29對病原菌的拮抗作用Table 1 Antagonistic effects of Bacillus subtilis D－29on pathogens

2.2 D－29蛋白粗提液活性測定結(jié)果

由圖1可以看出，隨著硫酸銨飽和濃度的增大，有效物質(zhì)的沉淀量逐步增大，拮抗活性隨之上升，而上清液對玉米大斑病菌的抑制作用成逐漸下降的趨勢。當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到80%時抑菌活性最強(qiáng)，上清液拮抗活性最低（圖2）。確定抑菌蛋白最佳鹽析飽和度為80%。

圖1 不同飽和度硫酸銨沉淀抗菌蛋白抑菌活性Fig.1 Effects of different saturation of ammonium sulfate on inhibiting activity of antifungal protein

2.3 D－29蛋白粗提液的穩(wěn)定性測定結(jié)果

2.3.1 熱穩(wěn)定性

蛋白粗提液50℃處理60min后，活性與對照相比沒有變化，100℃60min后，仍保持了66%的抑菌活性（圖3）。結(jié)果表明D－29蛋白粗提液具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖2 硫酸銨沉淀抗菌蛋白抑菌活性Fig.2 Effect of ammonium sulfate on inhibiting activity of antifungal protein注：1：80%沉淀2：80%上清3：D－29無菌濾液4：NANote：1：80%precipitation 2：80%supernatant 3：germfree filtrate 4：NA

圖3 溫度對蛋白粗提液的活性影響Fig.3 Effect of temperature on on inhibiting activity of crude protein

2.3.2 pH 穩(wěn)定性

蛋白粗提液在pH 2.0～9.0范圍內(nèi)活性較穩(wěn)定，在pH 5.0～7.0時，抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為2.9cm。當(dāng)pH大于9.0時蛋白活性急劇下降。粗提蛋白在強(qiáng)酸條件下穩(wěn)定，但在強(qiáng)堿條件下抑菌活性不穩(wěn)定 （圖4）。

圖4 pH蛋白粗提液的影響Fig.4 Effect of pH on on inhibiting activity of crude protein

2.3.3 對有機(jī)溶劑的敏感性

蛋白粗提液經(jīng)有機(jī)溶劑處理后，乙醚處理抑菌活性不變，其它處理對抑菌活性略有影響，受影響最大的為丙酮處理，其抑菌活性為對照的86.2%（圖5）。該蛋白粗提液對供試有機(jī)溶劑均具有一定的穩(wěn)定性。

圖5 有機(jī)溶劑對菌株D－29蛋白粗提液的影響Fig.5 Effect of organic solvent on on inhibiting activity of crude protein

2.3.4 紫外照射穩(wěn)定性

蛋白粗提液經(jīng)不同時間的紫外照射后，抑菌活性沒有變化。結(jié)果表明該蛋白在紫外照射下具有穩(wěn)定性。

3 討論

枯草芽孢桿菌是一種嗜溫的好氧性產(chǎn)芽孢桿狀細(xì)菌，具有廣泛的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，易于商業(yè)化，因此一直是植病生物防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。很多優(yōu)良的枯草芽孢桿菌菌株已應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐［14］?？莶菅挎邨U菌能夠分泌多種抗菌蛋白抑制植物病原真菌和細(xì)菌的生長與繁殖［15，16］。

隨著對植物病害生物防治要求的提高。人們越來越多的把注意力投入到抑菌物質(zhì)的研究上。本研究中D－29對番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌等11種病原菌均有不同程度的抑制作用，具有廣譜抑菌活性。其中對玉米大斑病菌的抑制效果最好，抑菌率高達(dá)54.6%，形成最佳的病害菌株組合。獲得的蛋白粗提液耐高溫、耐強(qiáng)酸、對有機(jī)溶劑、光照不敏感，有利于生防產(chǎn)品的開發(fā)。通過對菌株D－29抑菌蛋白的蛋白的理化性質(zhì)研究，為蛋白的分離純化及揭示該菌生防機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

［1］E G Wulf，C M Mguni，K Mansfeld－Giese，et al.Biochemical and molecular characterization of Bacillus amyloliquefaciens，B.subtils and B.Pumilus isolates with distinct antagonistic potential against Xanthomonas campestris pv.campestris［J］.Plant Patho，2002，51（5）：574－584.

［2］Asaka O，Shoda M.Biocontrol of Rhizoctonia solation damping off of tomato with Bacillus subtilis RB14［J］.Applied and Environmental Microbiology，1996，62（11）：4081－4085.

［3］Sturz A V，Christie B R，Nowak J.Bacterial endophytes：potential role in developing sustainable systems of crop production［J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19（1）：1－30.

［4］陳志誼，高太東，嚴(yán)大富，等.枯草芽孢桿菌B－2916防治水稻紋枯病的田間試驗(yàn)［J］.中國生物防治，1997，13（2）：75－78.

［5］隋文志，丁麗俐，吳魁斌.枯草芽孢桿菌 HB－248防病增產(chǎn)效果研究［J］.現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，1995（3）：4－5.

［6］Raupach G S，Kloepper J W.Mixtures of plant grow promoting rhizobacteria enhance biological control of multiple cucumber pathogens［J］.Biological Control，1998，88（11）：1158－1164.

［7］Gueldner R C，Reilly C C，Pusey P L，et al.Isolation and identification of iturins as antifungal peptides in biological control of peach brown rot with Bacillus subtilis［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1988，36 （2）：366－370.

［8］陳中義，張杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（2）：97－103.

［9］談靜惠，康書靜，郝曉娟，等.地膚內(nèi)生細(xì)菌對番茄灰霉病菌的拮抗作用［J］.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2011，31（4）：326－331.

［10］路國兵，冀憲領(lǐng)，張瑤，等.桑樹內(nèi)生細(xì)菌的分離及生防益菌的篩選［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2007，33（3）：346－351.

［11］沈萍，范秀容.微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2003：30－65.

［12］沈萍，范秀容，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：高等教育出版社，1999（3）：111.

［13］翟茹環(huán)，尚玉珂，劉峰，等.枯草芽孢桿菌 G8抗菌蛋白的理化性質(zhì)和抑菌作用［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2007，34（6）：592－596.

［14］于淑池，張利平，王立安.拮抗細(xì)菌作為生物防治手段研究進(jìn)展［J］.河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，8（1）：62－66.

［15］Zhang T，Shi ZQ，Hu LB，et al.Antifungal compounds from Bacillus subtilis B－FS06inhibiting the grow aspergillus flavus［J］.World Journal Microbiol Biotechnol，2008（24）：783－788.

［16］陳中義，張杰，黃大昉.植物病害生防芽孢桿菌抗菌機(jī)制與遺傳改良研究［J］.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33（2）：97－103.