常金芳，郁建鋒，冀宏

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500）

白靈菇rDNA-ITS序列多態(tài)性分析

常金芳，郁建鋒，冀宏

（常熟理工學院生物與食品工程學院，江蘇常熟 215500）

為了研究10個不同來源的白靈菇品種親緣關(guān)系，采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析技術(shù)，系統(tǒng)分析了不同地區(qū)白靈菇ITS的多態(tài)性.用ClustalX、MEGA4等軟件分析結(jié)果顯示，10個不同來源的白靈菇具有很近的親緣關(guān)系，其中有9個品種的同源性高達98.5%，其可能來自同一品系，而另一個品種與其他9個差異較大，此可能來自其他品系或是一株突變品種.

白靈菇；rDNA-ITS序列；親緣關(guān)系

白靈菇屬于真菌門、擔子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、側(cè)耳屬，為掌狀白阿魏菇，卯曉嵐[1]將其命名為Pleurotus nebrodensis（Lnzengae）Quel.野生白靈菇在中國僅分布于新疆地區(qū)，其形狀似靈芝，菇體為純白色，肉質(zhì)細膩，味道鮮美，朵型適中，口感特佳，是一種名貴食（藥）用真菌[2].研究發(fā)現(xiàn)，白靈菇具有防治老年人心血管疾病、防癌抗癌等藥用功效[3].白靈菇含有多種營養(yǎng)成分，能調(diào)節(jié)機體生理平衡、增強人體免疫功能[4-5]，享有“西天白靈芝”、“天山神菇”之美譽，深受國內(nèi)外消費者的青睞，有廣闊的開發(fā)前景.

Internal transcribed spacer（ITS）序列進化速率較快且片段長度適中（高等真菌一般小于1000 bp），加上協(xié)同進化，使得其在基因組中不同重復單元間十分一致，成為高等真菌屬內(nèi)種間及種群系統(tǒng)學研究的基因標記[6].ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致，種間差異較為明顯.這種特點使ITS適合于真菌物種的分子鑒定及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[7-9].目前已被廣泛應用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中[10].

目前，白靈菇迅速走俏市場，其栽培規(guī)模也日益擴大，但由于命名的隨意性，生產(chǎn)中同種異名和同名異種現(xiàn)象嚴重，導致白靈菇栽培菌株混亂，影響了產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展.通過對10種不同生產(chǎn)區(qū)域來源的白靈菇ITS序列進行分析，探討其種內(nèi)和種間的遺傳變異，為白靈菇種質(zhì)鑒定及培育和優(yōu)產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，提供基礎(chǔ)保障.

1 材料與方法

1.1 菌種

分別從國內(nèi)不同區(qū)域的市場菌種銷售機構(gòu)購買了北京吉蕈天山1號、河北武安天山2號、北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號、江都天達白靈菇2號、福建龍海白靈菇、河南鄭州白靈菇3、高郵白靈菇1號、北京吉蕈高溫白靈菇、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇2號等10個不同命名的白靈菇菌種.

1.2 方法

1.2.1 白靈菇菌絲體培養(yǎng)

將10個不同命名的白靈菇菌種在PDA固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d后，接種約0.1 cm3大小的菌種塊于100 m L的PDA液體培養(yǎng)基，25℃靜置2 d后，180 r/m in繼續(xù)振蕩培養(yǎng)7 d[11].收集菌絲體，并保存于-70℃冰箱.

1.2.2 CTAB法提取基因組DNA

參照Guo[12]等和Saghai[13]等的方法，將上述操作收集到的菌絲體（濕重約0.6 g）置于陶瓷研缽中，加入適量的液氮進行研磨，將研磨得到的粉末轉(zhuǎn)移到1.5 m L EP管中，加入700μL裂解緩沖液（0.1 mol/L Tris-Hcl，pH 8.0；0.02 mol/L EDTA，pH 8.0；1.4 mol/L NaCl；2%CTAB），置于65℃水浴消化3～4 h.然后以酚、氯仿抽提法獲得白靈菇的基因組DNA，于-70℃保存.

1.2.3 PCR擴增ITS片段

ITS引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[10-11].PCR擴增100μL體系：70μL ddH2O，10μL 10×PCR buffer，8μL dNTP（2.5 mmol/L each），ITS1/ITS4（10 pmol/L）各2μL；5 ng DNA模板；1μL Taq酶（5 U/μL）.PCR擴增程序：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.

1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并克隆入pMD 18-T Vector，送至上海桑尼生物科技有限公司測序.

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Clustal X軟件和MEGA4.1軟件對所獲得的10個白靈菇ITS序列進行分析[14,16-17].采用最大簡約法，構(gòu)建系統(tǒng)樹，自展次數(shù)為1000次.

2 結(jié)果

2.1 ITS目的片段的擴增

以引物ITS1和ITS4擴增了10個白靈菇品種的ITS片段，從圖1可以看出供試菌株擴增出來的ITS片段約在680 bp左右，而北京吉蕈農(nóng)大白靈2號的PCR條帶明顯短于其余9個品種，基本與預期設(shè)計的片段大小相一致.

2.2 ITS序列分析

對10個白靈菇菌種的ITS序列對比分析（見圖2），結(jié)果顯示，北京吉蕈天山1號、河北武安天山2號、江都天達白靈菇2號、河南鄭州白靈菇3、北京吉蕈京白靈菇和高郵白靈菇1號的ITS序列是相同的；福建龍海白靈菇與北京吉蕈高溫白靈菇菌株的ITS序列是相同的.高郵白靈菇2號的ITS序列在第428個堿基處較其他白靈菇的多插入了1個堿基；北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號的ITS序列與其余9個菌種的差異性較大，存在較多的序列缺失[15].

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 10個白靈菇品種的遺傳距離

利用MEGA4.1軟件對10個白靈菇的ITS序列進行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果顯示（見表1），北京吉蕈天山1號、河北武安天山2號、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇1號、高郵白靈菇2號、河南鄭州白靈菇3和江都天達白靈菇2號兩兩之間的遺傳距離都為0.000，福建龍海白靈菇和北京吉蕈高溫白靈菇與以上7個品種之間的遺傳距離也只有0.007，說明這9個品種的白靈菇在ITS區(qū)的變異積累并不明顯.北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號與其余9個品種的遺傳距離較大，為4.337，推斷其與其他白靈菇的來源可能有所不同.

圖1 白靈菇ITS PCR產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

圖2 10個白靈菇品種的ITS區(qū)域序列對比結(jié)果

表1 以ITS序列獲得的10個白靈菇遺傳距離結(jié)果

2.3.2 系統(tǒng)進化樹

利用CLUSTALX1.83、MEG4軟件，以供試白靈菇菌株的ITS序列構(gòu)建其分子進化樹，進一步分析10個白靈菇之間的親緣關(guān)系.結(jié)果分析（圖3）顯示，10個白靈菇品種分為3大分支，北京吉蕈天山1號、河北武安天山2號、北京吉蕈京白靈菇、高郵白靈菇1號、高郵白靈菇2號、河南鄭州白靈菇3和江都天達白靈菇2號聚類于同一個分支，它們之間的自展支持率為91%，大于70%.而福建龍海白靈菇和北京吉蕈高溫白靈菇在同一個分支上，它們之間的自展支持率為88%，也大于70%，而后這2個分支聚類形成一個大的分支.北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號單獨形成一分支，也說明其與其他9個品種白靈菇的ITS發(fā)生了變異積累.

3 討論

圖3 基于ITS序列分析構(gòu)建的最簡約系統(tǒng)樹

本文對所克隆的10個來自不同地區(qū)的白靈菇的ITS序列進行了遺傳分析，并構(gòu)建了其系統(tǒng)發(fā)育樹.以北京吉蕈天山1號、河北武安天山2號之間的遺傳距離為0.000，在聚類分析中其也在同一分支上，福建龍海白靈菇、北京吉蕈高溫白靈菇之間的遺傳距離為0.000，且自展支持率為88%，與以上7個白靈菇品種的遺傳距離也只有0.007，推測這9個品種可能來自于同一品系，也有可能這9個品種的白靈菇ITS序列并沒有達到亞種的遺傳變異積累.而北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號與其余9個品種的遺傳距離為4.337左右，在聚類分析中單獨形成一分支，推斷其可能來源于其他品系或是產(chǎn)生的新突變株.

ITS區(qū)域的基因序列進化速率較快，且在基因組中不同重復單元之間基本一致，現(xiàn)為高等真菌屬種內(nèi)及種群系統(tǒng)學研究的基因標記之一[18-19].對10個來自不同地區(qū)的白靈菇ITS序列分析結(jié)果表明，只有北京吉蕈農(nóng)大白靈菇2號與其他的差異較大，而其余的差異不明顯.這說明此9個白靈菇品種可能來自同一品系的栽培種，也可能是ITS序列分析還不能十分精確地反映出這9個白靈菇之間的差異.因為ITS序列作為分子標記應用技術(shù)的最大限制是有的真菌由于進化順序、變異、甚至分析方法等原因，在間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異性較小，作為屬內(nèi)種及種群的標記存在著一定的不足[10，20].此研究結(jié)果雖然為白靈菇的種內(nèi)關(guān)系的研究提供了重要參考數(shù)據(jù)，但還需結(jié)合其他方法如SRAP標記的全基因分析、白靈菇的形態(tài)包括營養(yǎng)體和子實體的鑒定才能更為科學地鑒定不同來源、不同品系的白靈菇之間的親緣關(guān)系.

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An analysis of rDNA-ITS Sequence Polym orphism in Pleurotus nebrodensis

CHANG Jin-fang,YU Jian-feng,JIHong
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

In order to study the phylogenetic relationship of 10 Pleurotus nebrodensis strains collected from differ?ent regions,ITS sequence analysis was used.ITS sequences were amplified using primer ITS1(5′-TCCGTAGGT?GAACCTGCGG-3′)and ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′),and analyzed using ClustalX and MEGA4 software.The results showed that the ten P.nebrodensis had a very close relationship.The similarity of 9 strains was 98.5%and they might come from the same strain.The other one was a little different from them.It might come from the other strains or be amutant variety.

Pleurotus nebrodensis;rDNA-ITS sequence;phylogenetic relationship

Q933

A

1008-2794（2012）08-0061-05

2012-06-16

常熟市農(nóng)業(yè)科技項目“‘村企掛鉤’食用菌設(shè)施農(nóng)業(yè)標準化高效栽培技術(shù)集成與示范”（CN201001）；蘇州市應用基礎(chǔ)研究項目“白靈菇種質(zhì)資源評價及其工廠化栽培良種選育”（SYN201007）；江蘇省科技支撐計劃項目“食用菌低碳高效生產(chǎn)技術(shù)體系建設(shè)與示范”（BE2011456）

常金芳（1990—），女，江蘇鹽城人，生物工程專業(yè)2008級本科生.

冀宏（1969—），男，河北保定人，教授，博士，研究方向：食、藥用真菌工程技術(shù)，E-mail：jihong@cslg.edu.cn.