李淑芳 桑小軍

包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古包頭014010

神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)里面有自我增殖能力和多向分化潛能以及自我更新能力的多能干細(xì)胞，相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)可分化為神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞［1］。本實(shí)驗(yàn)從新生大鼠大腦勻漿分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，并且在普通血清內(nèi)進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，經(jīng)證實(shí)為星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，為體內(nèi)誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增殖修復(fù)神經(jīng)組織探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

干細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基包含DMEM/F12和B27以及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (bFGF)。nestin抗體，NSE，GFAP通用型免疫組化試劑盒，以上材料來源于武漢博士德生物工程有限公司。新生1日齡Wistar大鼠30只，包頭醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

無菌處死新生大鼠去大腦，加入胰酶和EDTA各1ml，恒溫37℃消化時(shí)間8min，使組織細(xì)胞分離，并且吸管輕輕吹打充分分離細(xì)胞，以便于計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)完畢后后稀釋至以1X105/ml接種細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，常規(guī)DMEM/F12和B27以及表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)培養(yǎng)。每6天傳代1次，根據(jù)顯微鏡下計(jì)數(shù)繪圖形成生長(zhǎng)曲線。

1.3 細(xì)胞免疫學(xué)鑒定

對(duì)連續(xù)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞和分化細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)檢測(cè)。神經(jīng)干細(xì)胞檢測(cè)指標(biāo)為nestin檢測(cè)，取出細(xì)胞爬片放到35 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗3次。4%冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗3次。然后0.2%Triton X－100通透10 min，PBS洗3次。接著與二抗相同宿主的血清封閉30min，PBS洗3次。一抗4攝氏度濕盒內(nèi)過夜，PBS洗3次。二抗室溫2h避光，PBS洗3次。最后蒸餾水洗掉PBS，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察，巢蛋白在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)，呈現(xiàn)紅色熒光。GFAP在細(xì)胞質(zhì)和表面突起呈現(xiàn)棕黃色。NSE在分化細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)18h通過相差顯微鏡觀察到部分細(xì)胞增殖分裂為細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞團(tuán)塊和數(shù)目隨時(shí)間而增加。在第24 h觀察到神經(jīng)干細(xì)胞聚集，48～72h形成球形團(tuán)塊，形態(tài)規(guī)則，突起不明顯。第8d可見數(shù)百細(xì)胞克隆團(tuán)塊呈現(xiàn)懸浮集落，部分細(xì)胞緊貼培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁，第4周時(shí)細(xì)胞克隆呈大小一致的大球形和小桑椹狀細(xì)胞克隆。細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示傳代至第7代細(xì)胞數(shù)量平均增加67倍 (表1)。培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞免疫熒光檢查細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)巢蛋白nestin，繼續(xù)培養(yǎng)反復(fù)傳代后仍然持續(xù)表達(dá) (圖1)。10%胎牛血清誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化細(xì)胞進(jìn)行HE染色，鏡下可見分化細(xì)胞多突起。免疫學(xué)顯示以NSE和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞為主 (圖2)。

表1 培養(yǎng)細(xì)胞計(jì)數(shù)

圖1 傳代細(xì)胞中巢蛋白表達(dá)

圖2 分化細(xì)胞免疫學(xué)顯示NSE

3 討論

神經(jīng)干細(xì)胞處于未分化狀態(tài)，在一定條件下分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞的特殊標(biāo)志物包括巢蛋白 (nestin)和波形蛋白，以及RCl抗原等。巢蛋白在神經(jīng)板上皮細(xì)胞即開始表達(dá)，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞的遷移基本完成后巢蛋白的表達(dá)量開始下降，并隨神經(jīng)細(xì)胞分化的完成而停止表達(dá)。巢蛋白被廣泛用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。［2，3］神經(jīng)元的標(biāo)志蛋白NSE是神經(jīng)元特異性烯醇化酶，是神經(jīng)元特異性蛋白。GFAP膠質(zhì)纖維酸性蛋白是存在與星形膠質(zhì)細(xì)胞中的特性標(biāo)志蛋白。兩種蛋白在分化細(xì)胞中的表達(dá)證實(shí)了所培養(yǎng)細(xì)胞克隆可以分化為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了所培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞克隆具有自我更新能力和多向分化潛能，具備神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)屬性。

相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)一定濃度的EGF對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖具有調(diào)節(jié)作用，可以促進(jìn)增殖［4］。本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察呈圓形或者橢圓形，體積較小，核質(zhì)比大，經(jīng)過HE染色鏡下課件對(duì)稱性核分裂像，細(xì)胞克隆可傳代7代以上。分化細(xì)胞為神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞。在此基礎(chǔ)下一步擬進(jìn)行神經(jīng)元損傷的體內(nèi)誘導(dǎo)分化和功能修復(fù)的研究。

［1］Ernst C，Christie BR.The putative neural stem cell marker，nestin，is expressed in heterogeneous cell types in the adult rat neocortex［J］.Neuroscience，2006，138(1):183－188.

［2］Sung CS，Wen ZH，Chang WK，et al.Inhibition of p38 mitogen－activated protein kinase attenuates interleukin－1［beta］－induced thermal hyperalgesia and inducible nitric oxide synthase expression in the spinal cord［J］.Neurochemistry，2005，94(3):742 －752.

［3］Claire Boissart，Xavier Nissan，Karine Giraud － Triboult，Marc Peschanski，and Alexandra Benchouaetal，miR － 125 potentiates early neural specification of human embryonic stem cells.Development and stem cells［J］.2012，139:1247－1257.

［4］Jing Zhou，Gayatri Shrikhande，Jing Xu，Renée M.McKay，Dennis K.Burns，Jane E.Johnson，and Luis F.Parada Tsc1 mutant neural stem/progenitor cells exhibit migration deficits and give rise to subependymal lesions in the lateral ventricle［J］.Research Communications，2011，25:1595 － 1600.