陳恒沖，馬彬峽，李景輝

(1．遼寧省本溪市藥品檢驗(yàn)所，遼寧 本溪 117000;2．遼寧省本溪市衛(wèi)生學(xué)校，遼寧 本溪 117000)

輪葉黨參為桔梗科黨參屬植物輪葉黨參Codonopsis lanceolataBenth．et Hook的干燥根，又名羊乳、山胡蘿卜、四葉參等，是藥食兼用的中藥材，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、潤肺生津、消腫排膿及解毒療瘡之功效[1]，主要分布于我國的東北三省及華北、華南和長江中下游地區(qū)，日本、朝鮮及俄羅斯等地也有分布。近年來，東北地區(qū)人工栽培面積逐年增加，主要出口東南亞的一些國家和地區(qū)，市場(chǎng)前景廣闊。到目前為止，輪葉黨參藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未被《中國藥典》及我國各地方中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載，對(duì)其性狀及顯微特征研究的報(bào)道較少[2]。在此深入研究了輪葉黨參的性狀及顯微特征，并建立了東北地產(chǎn)藥材的高效液相指紋圖譜，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

日本島津Shimadzu LC－10AT型高效液相色譜儀，Shimadzu SPD－10A型紫外檢測(cè)器，anstar色譜工作站，AE100型電子分析天平(瑞士梅特勒)。水(二次重蒸水，自制)，乙腈(山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠)為色譜純，甲醇(沈陽新興試劑廠)。齊墩果酸對(duì)照品購自中國藥品生物制品檢定所(批號(hào)為110709－200505);輪葉黨參皂苷對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)HPLC面積歸一化法測(cè)定純度在98%以上。輪葉黨參藥材共計(jì)10批，分別采自遼寧東部地區(qū)與吉林延邊地區(qū)，均經(jīng)遼寧省本溪市藥品檢驗(yàn)所劉鳳云主任中藥師鑒定，編號(hào)、產(chǎn)地見表1。

表1 相似度計(jì)算結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2．1 性狀鑒別

本品呈圓錐形或紡錘形，有的有分枝，扭曲不直，長6～15 cm，直徑2～6 cm。表面灰棕色至棕褐色，頂端有多數(shù)疣狀突起的莖痕及芽，每個(gè)莖痕呈圓形凹陷，根的上部有致密的橫環(huán)紋，向下漸稀疏而粗，全體有縱皺紋，粗糙不平，質(zhì)硬而脆，斷面略平坦，多裂隙，形成層環(huán)明顯，木部黃色，皮部類白色。氣微，味甜而苦。

2．2 顯微鑒別

橫切面顯微特征:木栓細(xì)胞10余列，外側(cè)4～9列為石細(xì)胞，石細(xì)胞長方形、類方形或多角形，切面排列，壁稍厚，紋孔及孔溝稀疏;栓內(nèi)層狹窄;韌皮部寬廣，外側(cè)多裂隙，篩管散列，大多與乳管群伴生，乳汁管內(nèi)含黃棕色微顆粒狀物;形成層不成環(huán);木質(zhì)部導(dǎo)管稀疏，單個(gè)散在或2～3成群放射狀排列;木射線寬廣。

粉末顯微特征:石細(xì)胞較多，成群存在，長方形、類方形或類多角形，細(xì)胞壁增厚不顯著，紋孔稀疏，孔溝不明顯，直徑76～145 μm;木栓細(xì)胞類長方形、類方形，切面觀排列較整齊;乳管相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀，直徑15～24 μm，內(nèi)含油滴狀物及顆粒狀物;木薄壁細(xì)胞淡黃色，類方形或長方形，細(xì)胞壁顯著增厚，3年生以上藥材呈連珠狀，直徑132～246 μm，有橫隔;主為網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑18 ～43 μm;有菊糖。

2．3 HPLC指紋圖譜研究

2．3．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱:Agilent TC－C18柱(250 mm×4．6 mm，5 mm);流動(dòng)相:以乙腈為流動(dòng)相 A，以0．15%磷酸為流動(dòng)相 B，梯度洗脫(0～20 min，11%A→16%A;20～35 min，16%A→28%A;35～60 min，35%A→60%A);檢測(cè)波長:207nm;柱溫:30℃;流速:1．0 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL。所有組分在60 min內(nèi)出峰完畢，理論板數(shù)按齊墩果酸色譜峰計(jì)算不低于10 000，齊墩果酸與相鄰色譜峰之間的分離度大于 1．5。

2．3．2 溶液制備

取本品粉末(過三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，精密加入甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補(bǔ)失質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，0．45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。分別精密稱取齊墩果酸[3]對(duì)照品5．25 mg，輪葉黨參皂苷[4]對(duì)照品5．06 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL，置于另一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成混合對(duì)照品溶液。

2．3．3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):取8號(hào)樣品，按2．3．2項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值基本一致(RSD為0．7% ～2．3%)，符合指紋圖譜要求。

重現(xiàn)性試驗(yàn):取同一樣品(8號(hào))5份，精密稱定，按2．3．2項(xiàng)下操作，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值基本一致(RSD為1．1% ～2．8%)，符合指紋圖譜要求。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下溶液，按上述色譜條件，分別在 1，4，8，16，24 h 時(shí)進(jìn)樣分析，記錄指紋圖譜。結(jié)果表明，各色譜峰對(duì)內(nèi)參比峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值基本一致(RSD為1．5% ～2．7%)，符合指紋圖譜要求。

2．4 HPLC指紋圖譜建立

測(cè)定了10個(gè)不同批次和產(chǎn)地的輪葉黨參樣品，記錄色譜圖，確定共有特征色譜峰17個(gè)，峰面積之和大于90%，指認(rèn)了2個(gè)色譜峰，分別為齊墩果酸(14號(hào)峰)和輪葉黨參皂苷(17號(hào)峰)。14號(hào)峰(齊墩果酸)為有效成分峰，切分離度較好，因此選其為參照峰。以17個(gè)特征峰對(duì)參照峰的相對(duì)保留時(shí)間定性指紋圖譜中特征峰及10批藥材指紋圖譜見圖1和圖2。指紋圖譜反映的是樣品整體的特征，進(jìn)行指紋圖譜比較，可以反映樣品之間的親疏程度，相似度可以定量地描述指紋圖譜，本研究采用夾角余弦和相關(guān)系數(shù)作為測(cè)度，以中位數(shù)矢量為共有模式，分別計(jì)算樣本的相似度。結(jié)果見表1。

3 討論

桔梗和黨參同樣是桔梗科的藥材，與輪葉黨參顯微特征的主要區(qū)別如下。1)石細(xì)胞:組織結(jié)構(gòu)上輪葉黨參石細(xì)胞位于木栓層外側(cè)4～9列，切面排列;黨參木栓層外側(cè)有單個(gè)或成群的石細(xì)胞;桔梗無石細(xì)胞。粉末特征中輪葉黨參石細(xì)胞成群存在，長方形、類方形或類多角形，細(xì)胞壁增厚不顯著，紋孔稀疏，孔溝不明顯;黨參石細(xì)胞單個(gè)散在或數(shù)個(gè)成群，呈多角形、類斜方形、短梭形或略呈分枝狀，紋孔稀疏，孔溝明顯。2)導(dǎo)管:輪葉黨參粉末主為網(wǎng)紋導(dǎo)管;黨參主為具緣紋孔、網(wǎng)紋及網(wǎng)紋具緣紋孔導(dǎo)管;桔梗除了具緣紋孔及網(wǎng)紋導(dǎo)管外，還有梯紋導(dǎo)管。3)木薄壁細(xì)胞:輪葉黨參粉末木薄壁細(xì)胞類方形或長方形，細(xì)胞壁顯著增厚，3年生以上藥材呈連珠狀;黨參木薄壁細(xì)胞不增厚;桔梗木薄壁細(xì)胞縱斷面觀長方形，末端壁細(xì)波狀彎曲。綜上所述，輪葉黨參的石細(xì)胞群、乳管群、木薄壁細(xì)胞顯微特征比較典型，石細(xì)胞具有與同科屬藥材相區(qū)別的特征。

圖1 輪葉黨參HPLC指紋圖譜

圖2 10批輪葉黨參藥材的疊加指紋圖譜及共有模式

本試驗(yàn)先以甲醇為溶劑比較回流和超聲兩種提取方法，結(jié)果兩者所得色譜峰的峰數(shù)區(qū)別不大，回流提取所得主峰的峰面積較大;后又對(duì)甲醇、50%甲醇、95%乙醇、50%乙醇等提取溶劑進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)甲醇提取后所得色譜峰的峰數(shù)為最多。因此，本文采用甲醇作為提取溶劑進(jìn)行回流提取。

考察了207，219，254 nm波長下的指紋圖譜，在207 nm處齊墩果酸和輪葉黨參皂苷有較強(qiáng)的吸收，檢測(cè)到的色譜峰數(shù)量最多，特征性強(qiáng)，具有良好的代表性，故選擇207 nm作為檢測(cè)波長。

10批藥材指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果在0．84～0．99之間，符合指紋圖譜要求，可以作為評(píng)價(jià)輪葉黨參藥材質(zhì)量優(yōu)劣的方法之一。其中1批相似度低于0．90，說明該批藥材質(zhì)量一般，與外觀性狀反映的藥材質(zhì)量一致;其余9批相似度均大于0．90，說明藥材品質(zhì)基本一致。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院．中藥大辭典[M]．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977:195．

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