裴東明，杜光玲，李海霞，進茜寧，湯繼華，胡彥民，周警疆

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450002;2.英國洛桑研究所，英國，哈彭登AL52JQ)

玉米作為轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要的研究對象受到世界各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)從玉米中獲得了可用的農(nóng)藝性狀［1］.目前，雖然已有從原生質(zhì)［2］、叢生芽［3］、懸浮細胞［4］、幼胚［5］等中獲得轉(zhuǎn)化成功的報道，但從整體的轉(zhuǎn)化情況看，用幼胚經(jīng)過誘導(dǎo)獲得的胚性愈傷組織是最好的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化及植株再生的受體材料.但由于玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)能力對基因型依賴性很強［6］，生產(chǎn)上常用自交系的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率不高，嚴(yán)重制約著玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率.國內(nèi)對玉米蚜蟲的研究內(nèi)容主要局限于防治技術(shù)方面，在生物學(xué)及生態(tài)學(xué)方面的研究僅是對玉米蚜蟲的發(fā)生規(guī)律進行了簡單的觀察記載.而國外從蚜蟲的生物學(xué)特性、寄主對蚜蟲繁殖的影響、危害玉米蚜蟲的種類、環(huán)境變化對蚜蟲繁殖的影響等方面進行了系統(tǒng)而全面的研究.大量研究結(jié)果表明，蚜蟲報警信息素的主要成分是［反］-β-法尼烯(Eβf).英國洛桑研究所從薄荷中克隆了［反］-β-法尼烯(Eβf)合成酶基因，并將其轉(zhuǎn)化到擬南芥中［7］，發(fā)現(xiàn)該基因的導(dǎo)入可以明顯降低蚜蟲對擬南芥的危害，說明了Eβf合成酶基因在植物抗蚜蟲方面的利用價值，為玉米抗蚜蟲轉(zhuǎn)基因的工作開辟了新途徑.目前，玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系研究大多集中在單因素對遺傳轉(zhuǎn)化率的分析上，包括自交系篩選、受體材料、培養(yǎng)基調(diào)適、載體系統(tǒng)優(yōu)化、輔助轉(zhuǎn)化、篩選標(biāo)記及標(biāo)記剔出等，盡管也獲得了一些有關(guān)玉米產(chǎn)量、品質(zhì)及抗性(抗蟲、抗病、抗寒和抗旱等)［8，9］性狀改良的研究結(jié)果，但轉(zhuǎn)化率總體上不高，離實用性基因工程平臺技術(shù)的要求還有相當(dāng)?shù)牟罹?所以本試驗旨在通過探索基因型、轉(zhuǎn)化載體等多因素對遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，以獲得較為理想的轉(zhuǎn)化體系.

1 材料與方法

1.1 材料

以自交系87-1和鄭22，雜交種87-1×鄭22、鄭22×87-1、鄭 58×HiⅡA 和昌7-2×HiⅡA為材料.農(nóng)桿菌菌株為LBA4404.

1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+500 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖.

繼代培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖.

再生培養(yǎng)基:N6+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+700 mg·L-1脯氨酸 +700 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖.

共培養(yǎng)培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖 +100 μmol·L-1AS，pH=5.8.

延遲培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +300 mg·L-1Cef，pH=5.8.

篩選培養(yǎng)基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +200 mg·L-1Cef+20 mg·L-1G418，pH 值 =5.8.

再生培養(yǎng)基:N6+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+700 mg·L-1脯氨酸 +700 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +100 mg·L-1Cef，pH=5.8.

1.3 方法

1.3.1 愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代 取人工套袋授粉10～14 d不同基因型的玉米幼雌穗，將其剝?nèi)グ~，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇浸泡1～2 min，在無菌條件下取出，并用無菌水沖洗3遍，用解剖刀切除子粒頂部，取長度約1～2 mm幼胚，接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上.每個基因型根據(jù)材料的多少重復(fù)20～30皿.在黑暗、26℃條件下進行愈傷組織誘導(dǎo).將誘導(dǎo)出的優(yōu)良胚性愈傷組織用鑷子夾成大小均勻一致的小塊，每皿放入25～30塊愈傷組織，轉(zhuǎn)入新鮮培養(yǎng)基中繼代14 d.

1.3.2 受體材料的預(yù)培養(yǎng) 轉(zhuǎn)化前3 d，挑選生長一致的繼代培養(yǎng)的優(yōu)良愈傷組織轉(zhuǎn)接1次，進行轉(zhuǎn)化前預(yù)培養(yǎng)，以使愈傷組織具有最旺盛的生命力，以最好的狀態(tài)接受農(nóng)桿菌侵染.

1.3.3 表達載體的構(gòu)建 本試驗所用抗蚜蟲基因EβF cds序列全長為1 652 bp.用限制性核酸內(nèi)切酶NotI從中間載體pART7-EβF(由英國洛桑研究所饋贈)上切下抗蚜蟲基因EβF片段(約3 800 bp)，將其定向連接在經(jīng)相同酶切的過渡質(zhì)粒載體pNMCS上，構(gòu)建成過渡載體pNMCS-EβF;再用限制性核酸內(nèi)切酶PacI和AscI分別酶切構(gòu)建好的過渡載體pNMCSEβF和攜帶有 Cre/loxp重組系統(tǒng)的質(zhì)粒載體pNCX，將切下的EβF片段(約4 000 bp)定向連接到經(jīng)雙酶切后的pNCX中，構(gòu)建成含Cre/loxp重組系統(tǒng)的表達載體 pNCX-EβF(圖1).另一表達載體pBJ40-EβF由英國洛桑研究所饋贈(圖2).

圖1 表達載體pNCX-EβF的構(gòu)建Fig.1 The construction of expression vector pNCX-EβF

1.3.4 表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 (1)挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落置于3 mL液體YEP培養(yǎng)基(含100 mg·L-1lRif和 50 mg·L-1Str)，28 ℃，200 r·min-1振蕩過夜培養(yǎng).

圖2 表達載體pBJ40-EβFFig.2 The expression vector pBJ40-EβF

(2)以1∶200接種于50 mL是YEP培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r·min-1搖菌至 0.5，冰浴 10 min.

(3)5 000 r·min-1，4℃離心10 min后棄上清液，收集菌體.

(4)棄去上清液，加入10 mL冰預(yù)冷的雙蒸水，吸打混合均勻，用雙蒸水調(diào)體積500 mL，混合均勻.再分別用250和50 mL雙蒸水重復(fù)(3)，(4)步驟2次.

(5)5 000 r·min-1，4℃離心10 min后棄上清液，用5 mL 10%預(yù)冷無菌甘油重懸菌體.

(6)以50 μL為單位分裝于1.5 mL無菌離心管中，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?

(7)取50 μL農(nóng)桿菌感受態(tài)置于冰上融化，加入 1 μL構(gòu)建好的質(zhì)粒 pNCX-EBF(或 pBJ40-EβF)，輕輕混勻.

(8)將混合物轉(zhuǎn)入冰預(yù)冷的電擊杯中.

(9)用Bio-Rad細胞融合儀進行電擊.Capacitance:25 Uf;Voltage:2.4 kV;Tesistance:2 000 hm;Plus length:5 ms.

(10)電擊后菌體立即加入1 mL YEP培養(yǎng)基(不含抗生素)，28 ℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)4～6 h.

(11)4 000 r·min-1，離心5 min，棄上清液，收集菌體，涂布于含有相應(yīng)抗生素(50 mg·L-1Kan，50 mg·L-1Str，100 mg·L-1Rif或 50 mg·L-1Sp，50 mg·L-1Str，100 mg·L-1Rif)的固體培養(yǎng)基平板上，28℃倒置培養(yǎng)3 d左右.

(12)挑取平板上長出的單菌落，接種于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，菌液PCR擴增鑒定.將鑒定正確菌液取700 μL加入1.5 mL滅菌離心管中，再加入50%的滅菌甘油300 μL混勻，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆?，近期使用也可?20℃短期保存.

1.3.5 農(nóng)桿菌的侵染和篩選 將預(yù)培養(yǎng)3 d的愈傷組織，轉(zhuǎn)化前將愈傷組織夾入三角瓶中，盡量不要帶培養(yǎng)基，倒入已準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌侵染液(N6+AS，pH 值 =5.2，OD 值為 0.3 左右)，完全浸沒愈傷組織.輕輕搖動數(shù)次后，靜止5～10 min，侵染完成，棄去菌液，用濾紙將愈傷組織吸干后置于含100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的繼代培養(yǎng)基上，25℃下避光共培養(yǎng)3 d.然后將玉米愈傷組織用無菌水沖洗2～3次，再用含有300 mg·L-1頭孢霉素(Cefotaxime，簡寫為Cef)的清洗液清洗1次，放于濾紙上吸干.轉(zhuǎn)入加有200 mg·L-1Cef的繼代培養(yǎng)基中，25℃暗培養(yǎng)7 d.再轉(zhuǎn)入加有Cef 100 mg·L-1和相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基上進行避光篩選，每代15 d，連續(xù)篩選2代，篩選完后轉(zhuǎn)入再生培養(yǎng)基進行植株再生.

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米受體材料的選擇

2.1.1 不同玉米基因型愈傷組織出愈率的差異

由于基因型的差異，幼胚的出愈率不盡相同(表1).從表1可以看出，雜交種87-1×鄭22和鄭22×87-1都有較高的出愈率和胚性愈傷率，87-1和鄭58×HiⅡA出愈率相對較高，但胚性愈傷率卻是較低，鄭22和昌7-2×HiⅡA出愈率不足90%，和其它幾種基因型的比較處于中上等水平，胚性愈傷率在50%，也是一般水平.

2.1.2 不同玉米基因型愈傷組織表型的差異 愈傷組織的劃分一般參照AMSTRONG等［10］的標(biāo)準(zhǔn):具有再生能力的愈傷組織根據(jù)生長狀況和再生途徑分為2類，即I型愈傷組織和II型愈傷組織.I型愈傷組織白色塊狀、堅硬、干燥、結(jié)構(gòu)緊密，難以長期繼代培養(yǎng)，主要通過器官發(fā)生途徑再生植株;II型愈傷組織乳白色或淺黃色、結(jié)構(gòu)松散易碎、呈顆粒狀、易產(chǎn)生胚狀體，適合長期繼代培養(yǎng)，主要通過胚狀體途徑再生植株，是理想的愈傷組織類型.后來根據(jù)不同試驗者的觀察又把結(jié)構(gòu)松軟、白色透明或半透明，水漬狀，不容易繼代培養(yǎng)，且喪失了分化能力、不能再生成苗的愈傷組織劃分Ⅲ型.

從表2可以看出，由于基因型的差異，誘導(dǎo)出來的愈傷組織形態(tài)也表現(xiàn)出了很大的區(qū)別.87-1、鄭22誘導(dǎo)出來的愈傷組織塊硬，屬于I型愈傷，繼代能力差，再生率低;87-1×鄭22、鄭22×87-1的愈傷組織色澤發(fā)黃，屬于Ⅱ型愈傷組織，兩者幾乎沒有差別;鄭58×HiⅡA誘導(dǎo)的愈傷組織塊硬且干燥，不適合繼代，明顯不如87-1×鄭22和鄭22×87-1的愈傷組織;昌7-2×HiⅡA的愈傷組織十分松散，呈明顯的米黃色顆粒狀，屬于較好的Ⅱ型愈傷組織.就雜交種而言，昌7-2×HiⅡA的愈傷組織最好，87-1×鄭22和鄭22×87-1的愈傷組織次之，鄭58×HiⅡA的愈傷組織較差.

表1 不同基因型愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果Table 1 The induction results of calli from different genotypes

表2 脫分化愈傷組織的生長狀況Table 2 The callus growth situation of dedifferentiation

2.1.3 不同玉米基因型愈傷組織繁殖能力的差異

誘導(dǎo)出來的愈傷組織進行繼代培養(yǎng)，各基因型的繁殖能力不同，使得愈傷組織的生長量差異也很明顯.表3顯示，基因型不同，愈傷組織的繁殖能力存在差異.自交系的繁殖能力普遍很弱，而雜交種中昌7-2×HiⅡA的繁殖繼代能力最強，明顯高于其他3個雜交種，這與昌7-2×HiⅡA的愈傷組織形態(tài)有很大的關(guān)系，昌7-2×HiⅡA的愈傷組織松散濕潤，呈明顯的米黃色顆粒狀，非常適合繼代.試驗中發(fā)現(xiàn)昌7-2×HiⅡA的愈傷組織的繁殖繼代能力會逐漸增強，繼代幾次后愈傷組織的色澤更加鮮亮、松散，狀態(tài)更好.

表3 不同基因型繁殖能力的比較Table 3 The comparison of reproductive capacity of different genotypes

綜合上述分析，昌7-2×HiⅡA為較好的愈傷組織培養(yǎng)材料.因此，下面的試驗將以昌7-2×HiⅡA的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體進行轉(zhuǎn)化效率的研究.

2.2 不同玉米表達載體對轉(zhuǎn)化效率的影響

通過以上步驟將攜帶有抗蚜蟲基因EβF的2個不同表達載體pNCX和pBJ40分別侵染玉米昌7-2×HiⅡA的愈傷組織，對抗性愈傷組織進行檢測后，進行植株再生，結(jié)果如表4.以pBJ40為載體轉(zhuǎn)化愈傷組織1 000塊，得到了65塊抗性愈傷組織，5棵再生苗;而以pNCX為載體轉(zhuǎn)化愈傷組織1 000塊，篩選后得到了620塊抗性愈傷組織，130棵再生苗.試驗中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)G418篩選后發(fā)現(xiàn)以pBJ40為載體的愈傷組織在篩選中愈傷組織迅速變褐變暗，且水漬現(xiàn)象嚴(yán)重，以pNCX為載體篩選時愈傷組織較鮮黃、干燥.因此，無論是從篩選中的狀態(tài)、篩選后的塊數(shù)，還是最終的再生苗數(shù)，都說明以pNCX為載體比以pBJ40為載體轉(zhuǎn)化效果好.

表4 不同玉米表達載體對目的基因轉(zhuǎn)化效率的影響Table 4 The influence of different expression vector on conversion efficiency of target gene

3 結(jié)論與討論

基因型是玉米組織培養(yǎng)過程中的一個重要因素，愈傷組織的質(zhì)量狀態(tài)是影響愈傷繼代的關(guān)鍵.付鳳玲等［11］研究指出，各種基因型之間愈傷組織誘導(dǎo)率差異較大.魏開發(fā)等［12］對玉米幼胚誘導(dǎo)愈傷組織的研究表明，基因型不同幼胚的發(fā)育情況不同，胚性愈傷組織誘導(dǎo)概率存在很大差異，自交系的可誘導(dǎo)性是可以遺傳的，即自交系的誘導(dǎo)概率高，其雜交后代也較容易誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織.有些材料雖然誘導(dǎo)出了愈傷組織，但繼代過程中逐漸褐化死亡，無法繼代下去.在試驗中還發(fā)現(xiàn)，足夠黑暗的條件下有利于愈傷組織的生長，愈傷組織表現(xiàn)為健壯、色澤鮮黃.暗度不夠時，愈傷組織容易轉(zhuǎn)成硬塊狀，失去顆粒結(jié)構(gòu)，向I型愈傷組織轉(zhuǎn)變.剛誘導(dǎo)出的愈傷組織比較堅硬，經(jīng)過3或4次繼代后，愈傷組織生長旺盛，色澤鮮亮，增殖快，是進行基因轉(zhuǎn)化的最好時期.

通過對各種基因型玉米幼胚的誘導(dǎo)以及愈傷組織的繼代，可以看出不同基因型的出愈率不同，愈傷組織的質(zhì)量和狀態(tài)不同.雜交種的出愈率明顯高于自交系.試驗數(shù)據(jù)顯示，雜交種87-1×鄭22，鄭22×87-1和昌7-2×HiⅡA的出愈率和繼代繁殖能力都很優(yōu)越，是良好的組織培養(yǎng)材料，昌7-2×HiⅡA的培養(yǎng)優(yōu)勢尤為明顯.

本試驗說明，以昌7-2×HiⅡA的愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化抗蚜蟲基因，以抗生素G418作為篩選劑時，從篩選時愈傷組織的生長狀態(tài)、篩選后所得到抗性愈傷的塊數(shù)及得到的再生苗數(shù)來看，表達載體pNCX的轉(zhuǎn)化效率明顯高于表達載體pBJ40.

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