魏 明 何 勇 金 強(qiáng) 田志宏

（長(zhǎng)江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 湖北 荊州 434025）

高羊茅（Festuca arundinacea）又名葦狀羊茅，葦狀狐茅，是禾本科羊茅屬（Fescue）多年生叢生草本植物，是冷地型禾本科草種中抗熱抗干旱性最強(qiáng)的草種之一[1]。近幾十年來(lái)，高羊茅越來(lái)越多的應(yīng)用于草坪，新品種也逐年增加。如何快速準(zhǔn)確地區(qū)分這些品種成為草坪工作者共同關(guān)注的問題。由于我國(guó)除少量的結(jié)縷草品種外，其余草種長(zhǎng)期以來(lái)一直依賴于國(guó)外引種[2]，加之國(guó)內(nèi)部分種子經(jīng)營(yíng)者片面追求經(jīng)濟(jì)效益而忽視質(zhì)量，造成國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上高羊茅品種混雜、親緣關(guān)系不清，給良種保護(hù)和新種開發(fā)帶來(lái)了極大的不便。

在成熟谷類種子中，總蛋白約為種子干重的7%～16%，其中大部分為貯藏蛋白。通常根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解性，將種子貯藏蛋白質(zhì)分為4類：水溶蛋白、鹽溶蛋白、醇溶蛋白和堿（或酸）溶蛋白[3]。禾本科種子中的貯藏蛋白，呈現(xiàn)豐富的多樣性，并且很少受植物生長(zhǎng)環(huán)境、世代和收獲年限的影響。貯藏蛋白是影響種子品質(zhì)的因素之一，自Bushuk于1978年提出醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝膠電泳（A-PAGE）方法以來(lái)[4]，種子貯藏蛋白便作為遺傳標(biāo)記已被廣泛應(yīng)用于禾谷類作物種、屬間關(guān)系、種內(nèi)遺傳多樣性分析、品種鑒定及植物繁育系統(tǒng)的鑒別[5-10]，但在草坪草的品種鑒定方面卻鮮有報(bào)道。

為了滿足我國(guó)草坪業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展需求，本文采用種子貯藏蛋白電泳技術(shù)，對(duì)市售高羊茅種子進(jìn)行貯藏蛋白分析，以求從蛋白質(zhì)水平上探討高羊茅的遺傳多樣性，闡明其種子蛋白水平的遺傳差異，為高羊茅品種間遺傳差異及高羊茅種質(zhì)資源的分類鑒定提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選用近年來(lái)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)較為常見的18個(gè)高羊茅品種（表1）。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

每個(gè)品種取完整籽粒200粒，去穎殼后經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，取樣品0.08g裝入1.5mL離心管中，加入樣品提取劑1mL，震蕩5min搖勻。在室溫下放置（水溶蛋白室溫浸提24h，醇溶蛋白室溫浸提12h），再將離心管轉(zhuǎn)移至沸水浴中煮沸10 min，最后在12000r/min的速度下離心10min，上清液即為種子貯藏蛋白質(zhì)的提取液，取上清液4℃貯藏備用[11]。

表1 供試高羊茅品種表

1.2.2 電泳

參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《玉米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法》（NT/T499-2001）[12]中的乳酸－聚丙烯酰胺凝膠電泳方法，對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)（表2），使用北京六一儀器廠制造的DYY-10三恒型電泳儀和DYY-Ⅲ28B型垂直雙板夾芯式電泳槽，水溶蛋白用50%甘油做提取劑，醇溶蛋白用75%乙二醇做提取劑，不連續(xù)SDS-PAGE濃縮膠的濃度為5%，分離膠濃度為12%可以達(dá)到最佳的分離效果。濃縮膠、分離膠配方見表2。

表2 凝膠的配制

1.2.3 染色

膠板剝離后，加入至少5倍分離膠體積的固定液（80%甲醇，20%冰乙酸）固定1 h，溴酚藍(lán)指示劑由藍(lán)色變?yōu)辄S色后，倒去固定液，蒸餾水沖洗數(shù)次，加入與固定液等體積染色液（0.125 g考馬斯亮蘭R-250溶于250 mL固定液）染色3 h以上或40℃染色40 min，倒去染色液，蒸餾水沖洗數(shù)次，洗凈凝膠表面殘留染色液[22-24]，（5%甲醇、7.5%冰乙酸）震蕩脫色，每30 min更換一次脫色液，直至背景脫至無(wú)色，10%的醋酸溶液中保存或拍照保存。

1.2.4 貯藏蛋白電泳譜帶統(tǒng)計(jì)及聚類分析

用0、1表示電泳譜帶的有無(wú)，在相同遷移位置上有蛋白質(zhì)譜帶的記為1，無(wú)帶記為0，建立資料數(shù)據(jù)庫(kù)并使用軟件NTSYSpc 2.1進(jìn)行高羊茅品種聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水溶蛋白譜帶分析

18個(gè)品種的高羊茅種子水溶蛋白共表現(xiàn)出20條譜帶（圖1、圖2），最多的表現(xiàn)出18條帶，最少的表現(xiàn)出15條帶，但各品種間的條帶差異不大，特異性的條帶不多（圖2）。

圖1 18個(gè)品種的高羊茅種子水溶蛋白電泳圖譜

圖2 18個(gè)品種的高羊茅種子水溶蛋白電泳圖譜示意圖

2.2 醇溶蛋白譜帶分析

18個(gè)品種的高羊茅種子醇溶蛋白共表現(xiàn)出27條譜帶（圖3、圖4），最多的表現(xiàn)出24條帶，最少的表現(xiàn)出11條帶。條帶特異性比較明顯（圖4）。

圖3 18個(gè)品種的高羊茅種子醇溶蛋白電泳圖譜條帶

圖4 18個(gè)品種的高羊茅種子醇溶蛋白電泳圖譜條帶

2.3 貯藏蛋白譜帶聚類分析

高羊茅貯藏蛋白中的鹽溶蛋白和醇溶蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜，從不同角度反映了供試品種的蛋白質(zhì)多態(tài)性，但進(jìn)行綜合比較發(fā)現(xiàn)用水溶蛋白做聚類分析效果不佳，不能完全區(qū)分品種，因此采用醇溶蛋白來(lái)做聚類分析。

表3 18個(gè)品種的高羊茅遺傳相似性系數(shù)

按Nei氏 （1983）公式計(jì)算品系間的遺傳相似性系數(shù)（GS）（表 3）。 GS＝2Nij/（Ni＋Nj），其中 Ni為材料 i中出現(xiàn)的條帶數(shù)，Nj為材料j中出現(xiàn)的條帶數(shù)，Nij為材料i和材料j共有的條帶數(shù)。遺傳差異即遺傳距離GD=1-GS。遺傳相似系數(shù)從 0.3333333到 0.9629630。

以各品種遺傳相似系數(shù)為基礎(chǔ)，利用軟件NTSYSpc 2.1中的非加權(quán)組法（UPGMA）進(jìn)行高羊茅品種聚類分析，從圖5看來(lái)，以帶型遺傳相似性系數(shù)GS＝0.67為度，可將18個(gè)供試品種劃分為2個(gè)類群：園里、RTF、凌志Ⅱ、千年盛世、雅典娜、踏火、紅寶石、3A、貝殼、愛瑞3號(hào)和頂峰聚為一類（類Ⅰ）；時(shí)尚、翠碧A、法恩、銳步、火鳳凰、獵狗5號(hào)和選手聚為另一類（類Ⅱ）。

圖5 18個(gè)品種的高羊茅聚類分析樹狀圖

3 討論

分子生物學(xué)研究表明，品種之間的差異主要取決于遺傳物質(zhì)的差異，蛋白質(zhì)是基因的產(chǎn)物，可作為品種鑒定的依據(jù)[13]。本實(shí)驗(yàn)利用SDS-PAGE對(duì)市售的18個(gè)品種的高羊茅種子貯藏蛋白進(jìn)行分析，共得到水溶蛋白譜帶20條、醇溶蛋白譜帶27條，綜合比較后發(fā)現(xiàn)各品種間的水溶蛋白譜帶差異不大，特異性的條帶不多，醇溶蛋白譜帶特異性比較明顯，遺傳相似系數(shù)從0.3333333到0.9629630，可見在高羊茅品種間有一定數(shù)量的種子貯藏蛋白編碼基因的等位變異，同時(shí)也表明通過種子貯藏蛋白電泳可對(duì)高羊茅的品種鑒定以及育種和種植提供一定的參考，但在育種工作中，尚需要結(jié)合不同品種的性狀表現(xiàn)，對(duì)這些品種的聚類分析結(jié)果給以合理的理解，并將其應(yīng)用在親本選配中進(jìn)行生態(tài)育種。由于并非所有的基因都編碼或影響種子貯藏蛋白，所以有些重要性狀的遺傳尚需要結(jié)合同功酶或DNA譜帶的分析。

在不連續(xù)電泳系統(tǒng)中，濃縮膠的存在可濃縮樣品、提高電泳譜帶的分辨率，但減少了分離膠的有效面積和樣品的電泳距離，使電泳譜帶不能很好地加以區(qū)分[8]，這種情況在本實(shí)驗(yàn)中也有發(fā)生，在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中將根據(jù)實(shí)際情況做進(jìn)一步改進(jìn)，使之更加體現(xiàn)品種鑒定高效、快速的特點(diǎn)。

［1］孫吉雄.草坪學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2003，3：89-90.

［2］高志民，王雁.草坪草引種栽培研究現(xiàn)狀及存在的問題[J].中國(guó)草地，2000（3）：60－65.

［3］阮禹松，趙文明.種子鹽溶球蛋白的結(jié)構(gòu)特征[J].西北植物學(xué)報(bào)，2002，22（4）：999－1003.

［4］Bushuk W.Wheat cultivar identification by gliadin electrophoregrams[J].Can J Plant Sci， 1978，58：505－515.

［5］胡志昂，王洪新.蛋白質(zhì)多樣性和品種鑒定[J].植物學(xué)報(bào)，1991，33（7）：556-564.

［6］馬瑞君，李常寶，劉艷玲，等.四種沙棘種子可溶性蛋白譜帶分析研究[J].沙棘，1997，10（3）：3-9.

［7］黃秀麗，莊東紅，胡忠，等.南瓜屬4個(gè)栽培種種子蛋白質(zhì)電泳分析[J].武漢植物學(xué)研究，2005，23（2）：183－187.

［8］孫雁，朱有勇，朱永平，等.蛋白質(zhì)電泳在豌豆品種鑒定中的應(yīng)用[J].種子，2004，23（2）：25，30.

［9］J.L.Karihaloo ， Manjeet Kaur and Sonika Singh.Seed protein diversity in Solanum melongena L.and its wild and weedy relatives[J].Genetic Resources and Crop Evolution，2002，49：533-537.

［11］馬國(guó)芳，李鈞敏，邊才苗.白菜種子貯藏蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析[J].中國(guó)蔬菜，2004（3）：33，34.

［12］NT/T499-2001米種子純度鹽溶蛋白電泳鑒定方法[S].

［13］顏啟傳，鄧光聯(lián)，支巨振.農(nóng)作物品種電泳鑒定手冊(cè)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1998.