楊麗麗，尹寶華，侯文菊，石慧清

（山西舜天農(nóng)業(yè)微生物科學(xué)技術(shù)研究院，山西陽(yáng)泉045000）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類好氧或兼性厭氧、在一定條件下能產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生孢子的有機(jī)化能異養(yǎng)菌。它們?cè)谧匀唤绶植挤浅V泛，生理特性豐富多樣，主要存在于土壤、植物體表面及水體中，由于它們能夠產(chǎn)生對(duì)熱、紫外線、電磁輻射和某些化學(xué)藥品有很強(qiáng)抗性的芽孢，能忍受多種不良環(huán)境[1]，因此，芽孢桿菌在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、工業(yè)和環(huán)境污染治理等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

微生物菌種在自然條件下發(fā)生突變的概率較低，且突變幅度也不大，基因結(jié)構(gòu)一般很難發(fā)生改變。因此，單純依賴微生物群體的自然突變來(lái)選育特異性菌株遠(yuǎn)不能滿足生產(chǎn)和研究需要。隨著生命科學(xué)的發(fā)展以及學(xué)科交叉的深入，誘變育種技術(shù)得到不斷發(fā)展和創(chuàng)新，從而為篩選更多高效菌種提供了技術(shù)上的可能和便利。

誘變育種是以誘變劑誘發(fā)基因突變，通過(guò)篩選突變體，尋找正向突變菌株的一種誘變方法[1]。該技術(shù)突變率高，在較短時(shí)間內(nèi)能獲得更多的優(yōu)良變異類型，且誘變手段多樣、操作簡(jiǎn)便。因此，是實(shí)驗(yàn)室研究及工業(yè)生產(chǎn)中最常采用的優(yōu)良菌株選育方式。目前，物理誘變、化學(xué)誘變和生物誘變是3種常見(jiàn)的誘變方法。目前，國(guó)內(nèi)還未見(jiàn)有關(guān)芽孢桿菌的綜述性研究報(bào)道。

本文綜述了國(guó)內(nèi)近年來(lái)應(yīng)用于芽孢桿菌的誘變育種技術(shù)，旨在為芽孢桿菌高效誘變育種提供理論依據(jù)。

1 物理誘變育種

目前，發(fā)現(xiàn)的主要物理誘變方法有X射線、紫外線、γ射線、α射線、β射線、中子、超聲波、激光、宇宙射線和離子輻照誘變育種等[2-3]。

1.1 紫外線誘變技術(shù)

紫外線誘變技術(shù)是誘變和篩選優(yōu)良菌株的常規(guī)育種方法。紫外線專一性作用于嘧啶，主要使相鄰的嘧啶堿基尤其是胸腺嘧啶之間發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成的嘧啶二聚體會(huì)阻礙堿基間的正常配對(duì)，導(dǎo)致突變甚至死亡[4]。因紫外誘變技術(shù)具有設(shè)備簡(jiǎn)單、誘變效率高、操作安全簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。

因菌種差異，紫外線對(duì)各種微生物的誘變效應(yīng)截然不同。通常情況下，經(jīng)紫外照射3～5 min即可使微生物營(yíng)養(yǎng)體致死，但芽孢桿菌較特殊，約需10 min。另外，可見(jiàn)光修復(fù)是微生物紫外誘變后不容忽視的問(wèn)題。一般為降低可見(jiàn)光的修復(fù)率，可在誘變后冰浴2 h或暗培養(yǎng)1 d。利用紫外誘變已選育出了大量?jī)?yōu)良微生物菌種[5]。

高淑紅等[6]用紫外誘變育種方法，由枯草芽孢桿菌D-2誘變得到遺傳穩(wěn)定性良好的莽草酸缺陷型突變株D-202。其在2 t發(fā)酵罐中發(fā)酵單位可達(dá)到50 g/L。肖湘政等[7]用紫外線誘變膠質(zhì)芽孢桿菌HM8841，誘變出了發(fā)酵周期短、抗逆性強(qiáng)的菌株。王洲等[8]采用紫外線對(duì)產(chǎn)α-ALDC的枯草芽孢桿菌進(jìn)行誘變，得到2株比原菌株酶活分別提高107.62%和162.25%的菌株。張智等[9]對(duì)枯草芽孢桿菌Ls-02進(jìn)行紫外誘變，選育出1株遺傳性穩(wěn)定的枯草芽孢桿菌Ls-02-45。

1.2 激光誘變技術(shù)

激光因具有操作簡(jiǎn)單、安全、變異率高、輻射損傷輕等特點(diǎn)，在工業(yè)微生物育種中得到廣泛應(yīng)用[2]。生物有機(jī)體直接或間接地受到激光輻射產(chǎn)生的光、熱、壓力和電磁場(chǎng)效應(yīng)綜合作用的影響，引起了細(xì)胞染色體畸變、酶的激活或鈍化、細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝活動(dòng)的改變。細(xì)胞內(nèi)含物中的任何物質(zhì)一旦發(fā)生改變，都可能導(dǎo)致生物有機(jī)體在細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)特性上發(fā)生變異[4]。同種生物有機(jī)體被不同種類激光輻射后，會(huì)表現(xiàn)出不同的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)變化，這為生物誘變育種提供了有利條件[5]。黃建新等[10]發(fā)現(xiàn)，He-Ne激光對(duì)產(chǎn)α-乙酸乳酸脫羧酶的地衣芽孢桿菌具有明顯的誘變作用，在合適的照射劑量下，使其產(chǎn)酶能力比原菌株提高了2倍以上。

1.3 微波誘變技術(shù)

微波是一種具有波動(dòng)性和高頻性的電磁波[5]，它與生物組織的相互作用主要表現(xiàn)為熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，能刺激水、蛋白質(zhì)、核酸、脂肪和碳水化合物等極性分子快速振動(dòng)。這種振動(dòng)引起的摩擦能夠?qū)滏I、疏水鍵和范德華力產(chǎn)生作用，使DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致遺傳變異。微波誘變?cè)O(shè)備簡(jiǎn)單、方法易行、操作安全，誘變效果比傳統(tǒng)的誘變方法好，在工業(yè)微生物菌種選育中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。顏賢仔等[11]研究表明，通過(guò)微波誘變技術(shù)對(duì)產(chǎn)淀粉酶的枯草芽孢桿菌7658進(jìn)行誘變，可以有效改善其產(chǎn)淀粉酶的能力。

1.4 γ射線誘變技術(shù)

γ射線高能量產(chǎn)生的電離作用，可直接氧化脫氧核糖的堿基或脫氧核糖的化學(xué)鍵，間接使水或有機(jī)分子產(chǎn)生自由基，導(dǎo)致DNA損傷，造成基因突變，還可引起染色體斷裂、倒位、缺失和易位等畸變，從而改變微生物遺傳性狀[4]。該誘變技術(shù)不但能獲得高突變率和寬突變譜，而且還有利于新突變型的篩選。但γ射線有一定的局限性，操作要求較高，且有一定的危險(xiǎn)性，通常在不能使用其他誘變劑進(jìn)行誘變育種時(shí)才使用。索晨等[12]利用60Coγ射線對(duì)1株產(chǎn)γ-聚谷氨酸的地衣芽孢桿菌進(jìn)行誘變，篩選得到1株高產(chǎn)突變株Bacillus licheniformis S16。

1.5 離子注入誘變技術(shù)

離子注入誘變技術(shù)具有高線性能量轉(zhuǎn)換值、集束性好、射程可控等優(yōu)點(diǎn)，因此，其具有突變率較高、突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩(wěn)定等特點(diǎn)，是一種很有潛力的誘變選育新方法。近幾年，離子注入誘變技術(shù)發(fā)展非常迅速，應(yīng)用普及較快，尤其在微生物改良、選育優(yōu)良工業(yè)微生物菌株方面不僅帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益，而且?guī)?lái)巨大的社會(huì)效益。陳志誼等[13]利用不同劑量N+對(duì)枯草芽孢桿菌生防菌B-916進(jìn)行離子注入處理，獲得了拮抗能力比原菌株提高10%以上，且遺傳性較穩(wěn)定的突變菌株。

2 化學(xué)誘變育種

化學(xué)誘變是指利用一些化學(xué)物質(zhì)提高生物的自然突變率?；瘜W(xué)誘變具有突變率高，位點(diǎn)特異性強(qiáng)；對(duì)處理材料損傷輕，染色體畸變比例少，極少有致死型發(fā)生；價(jià)格便宜，操作簡(jiǎn)單，不需要特殊設(shè)備等特點(diǎn)。烷化劑是芽孢桿菌誘變育種中最常使用的誘變劑[5]。烷化劑具有一個(gè)或多個(gè)易取代DNA分子中活潑氫原子的活性烷基，能夠烷化DNA分子上的堿基及部分磷酸，使得DNA復(fù)制時(shí)常發(fā)生堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變[2]。常用的烷化劑有亞硝基胍、乙基硫酸甲烷、硫酸二乙酯、乙烯亞胺等。有研究表明，對(duì)多黏類芽孢桿菌進(jìn)行亞硝基胍誘變后，獲得比原菌株提高106%發(fā)酵單位的菌株[14]。孫金鳳等[15]用1株殼聚糖酶活較高的芽孢桿菌菌株，經(jīng)硫酸二乙酯（DES）誘變處理50 min后，篩選得到殼聚糖酶活明顯提高的突變株DES-4，其殼聚糖酶活為26.7 nkat/mL，是原菌株的2.7倍。

3 生物誘變育種

目前，按誘變方式可將生物誘變劑分為3大類：轉(zhuǎn)導(dǎo)誘發(fā)突變、轉(zhuǎn)化誘發(fā)突變和轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變[2]。其中，應(yīng)用最廣泛的是轉(zhuǎn)座誘發(fā)突變。王玉飛等[16]用含轉(zhuǎn)座子Tn917的質(zhì)粒pLTV3轉(zhuǎn)化炭疽桿菌，對(duì)2 000個(gè)突變體進(jìn)行了篩選，從中得到6株芽孢形成缺陷型突變株。

4 復(fù)合誘變育種

微生物突變機(jī)制復(fù)雜，單一誘變往往難以達(dá)到預(yù)期目的。因此，誘變育種往往采用組合2種或2種以上化學(xué)或其他誘變劑的育種方法，即復(fù)合誘變，其具有協(xié)同效應(yīng)。2種或多種誘變劑的先后使用、同一種誘變劑的重復(fù)作用、2種或多種誘變劑的同時(shí)使用都較單一誘變效果好[17]。尹明浩等[18]采用紫外-硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法，選育出1株高產(chǎn)3-羥基丁酮的枯草芽孢桿菌。張敏等[19]對(duì)枯草芽孢桿菌515菌株進(jìn)行紫外線、氯化鋰、硫酸二乙酯的復(fù)合誘變，獲得了1株遺傳穩(wěn)定性高的產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的活性菌株。李欣等[20]利用紫外線照射和快中子輻射相結(jié)合的方法，對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行誘變，獲得1株搖瓶效價(jià)較原菌株提高23%的突變株B-55。

5 小結(jié)與展望

綜上所述，關(guān)于芽孢桿菌誘變育種的方法多種多樣，但具體的芽孢桿菌誘變育種還存在不少問(wèn)題。由于單一的手段往往難以誘變得到活性較高的菌株，在生產(chǎn)中就要運(yùn)用各種復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)其誘變，以獲得優(yōu)良菌種。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展、科研水平的提高，芽孢桿菌與人們的日常生活更為密切，它作為一種十分重要的工業(yè)微生物菌種，越來(lái)越引起人們的普遍關(guān)注和青睞。目前，芽孢桿菌在農(nóng)作物病害防治、飼料加工、環(huán)境治理等方面的研究還處于起步階段，具有廣闊的發(fā)展前景。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展以及對(duì)誘變育種技術(shù)的深入研究，把分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于芽孢桿菌的研究，也將成為熱點(diǎn)。芽孢桿菌誘變育種豐富和拓寬了菌種的變異類型，尤其是自然界少有的性狀變異，增加了可利用的基因資源，也使誘變篩選效率得到進(jìn)一步提高。

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