王 霞 ，馬燕斌 ，吳 霞 ，梁愛華 ，馬冬菊 ，王 華 ，李燕娥

（1.運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系，山西運(yùn)城044000；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；3.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006）

草甘膦是一種廣譜性滅殺除草劑。由于其具有在土壤中極易降解和對(duì)環(huán)境幾乎不造成為害等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)得到大面積推廣使用[1]。但是在農(nóng)田中使用草甘膦滅殺雜草的同時(shí)，往往也會(huì)對(duì)作物造成損害。

為此，研究培育具有抗或耐草甘膦除草劑的作物新品種成為育種的重點(diǎn)目標(biāo)。棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，其中，國(guó)內(nèi)以山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所為代表的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的成功研制，極大地促進(jìn)了我國(guó)棉花的生產(chǎn)發(fā)展，也為以后我國(guó)新的轉(zhuǎn)基因棉花選育改良等研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[2-4]。

結(jié)合現(xiàn)階段棉花生產(chǎn)的實(shí)際發(fā)展需求，筆者對(duì)我國(guó)在抗草甘膦除草劑棉花的研究應(yīng)用等相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行了概括探討。

1 草甘膦除草劑與棉花的抗草甘膦對(duì)策

植物能夠通過莖葉吸收草甘膦，而草甘膦是通過抑制植物體內(nèi)芳香族氨基酸合成途徑中的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS酶）的活性，阻斷芳香族氨基酸的合成，從而殺滅雜草。由于草甘膦對(duì)所有植物的該代謝途徑作用效果相同，所以，在草甘膦殺滅雜草時(shí)，對(duì)所有植物的作用機(jī)理相同。因此，除草劑的使用實(shí)現(xiàn)了對(duì)作物田內(nèi)雜草的免除，同時(shí)也可降低勞動(dòng)力的使用及提高生產(chǎn)效率，但由于作物本身對(duì)草甘膦不具有耐藥性，因而，草甘膦的使用也會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生藥害。

針對(duì)這一狀況和潛在的商業(yè)利益，各國(guó)科研工作者開始進(jìn)行抗草甘膦育種的研究。我國(guó)科研人員也進(jìn)行了積極的研究來防止其為害發(fā)生，并取得了一定的成果。解決方法除了通過在田間噴灑除草劑進(jìn)行預(yù)防外，通過常規(guī)育種選育和基因工程等手段來獲得抗除草劑的棉花等作物，也是解決這一問題的有效途徑。具體的方法原理包括幾點(diǎn)。

一是通過不同草甘膦濃度水平脅迫的方法選擇育種。這一手段的目的是在一定濃度的草甘膦抑制前提下，植物體內(nèi)仍有足夠的EPSPS酶進(jìn)行正常代謝，最終使選育出的作物耐草甘膦性提高。二是通過分子技術(shù)手段。其包括過量表達(dá)作物自身的EPSPS酶、對(duì)EPSPS酶本身進(jìn)行突變修飾以及對(duì)EPSPS酶的代謝途徑進(jìn)行修飾，使作物的EPSPS酶降低或不受草甘膦抑制而保持正常的代謝。三是利用某些微生物的EPSPS酶。該方法與第2種方法類似，但由于親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，蛋白序列差異較大，因此，篩選到不受草甘膦抑制或受抑制作用較小的EPSPS酶的可能性較大。四是尋找能夠分解代謝草甘膦的基因，將這一類基因轉(zhuǎn)入目標(biāo)植物后在細(xì)胞內(nèi)形成一類防護(hù)機(jī)制，從而保護(hù)目標(biāo)植物不受草甘膦藥害。五是通過物理或化學(xué)等手段處理（包括體細(xì)胞誘變、輻照和化學(xué)誘變劑等）作物后獲得抗性基因突變體植株。這一方法操作簡(jiǎn)單，篩選的基因型突變有可能更加廣泛，但能夠獲得抗性植株的概率較小，且基因型突變鑒定的后期工作量較大。

2 抗草甘膦基因來源及相關(guān)分子生物學(xué)研究

研究表明，EPSPS酶和GAT基因編碼的草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)Σ莞熟⒖剐云鸬揭欢ㄗ饔?，其中，?duì)EPSPS酶的研究較多，應(yīng)用也較為廣泛，而草甘膦N-乙酰轉(zhuǎn)移酶及其GAT編碼基因的研究相對(duì)較少。目前，通過生物工程手段利用的主要是抗草甘膦EPSPS合成酶，根據(jù)基因序列比對(duì)和抗體試驗(yàn)結(jié)果，該基因可分為EPSPSⅠ和EPSPSⅡ。這2類EPSPS基因的序列同源性僅為50%左右，抗體作用不發(fā)生交叉反應(yīng)，且這2類編碼基因來源廣泛，包括各類植物和微生物。

劉柱等[5]從極端污染的土壤中分離到1株對(duì)草甘膦有極端抗性的細(xì)菌菌株HTG7。它能夠在以草甘膦為選擇壓力的限制性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其最高耐受能力為500mmol/L。劉光全等[6]通過PCR突變技術(shù)獲得了具有EPSPS酶功能而不具有草甘膦抗性的Pmu1和Pmu2突變株，并通過蛋白結(jié)構(gòu)模擬和測(cè)序手段預(yù)測(cè)其突變位點(diǎn)對(duì)草甘膦抗性的重要性。

除通過對(duì)微生物的抗草甘膦特性進(jìn)行篩選獲得EPSPS基因外，在植物的EPSPS基因研究方面，尉萬聰?shù)萚7]通過草甘膦處理誘導(dǎo)大豆和棉花的表達(dá)，克隆了相關(guān)的63個(gè)有差異的EST序列。程海剛等[8]對(duì)青麻EPSPS基因在酵母中表達(dá)認(rèn)為，該基因具有生物學(xué)功能。周曉卉等[9]進(jìn)行了薤白EPSPS合成酶基因cDNA的克隆與原核表達(dá)分析，認(rèn)為薤白EPSPS對(duì)草甘膦具有一定的抗性。鄧運(yùn)濤等[10]對(duì)諸葛菜EPSPS基因5′端的克隆和序列進(jìn)行了分析。童旭宏等[11]克隆獲得了陸地棉的1個(gè)拷貝EPSPS基因，該基因編碼序列長(zhǎng)度為1 566 bp，其組織特異性表達(dá)具有一定的差異。

3 棉花及其他作物中EPSPS酶的研究

我國(guó)在抗草甘膦除草劑的轉(zhuǎn)基因棉花等方面進(jìn)行了較多研究。祝水金等[12]利用體細(xì)胞連續(xù)定向篩選技術(shù)，結(jié)合體細(xì)胞誘變技術(shù)獲得了非轉(zhuǎn)基因抗草甘膦棉花突變體株。陳旭升等[13]利用草甘膦篩選到1個(gè)抗草甘膦棉花種質(zhì)系G-6，通過抗性遺傳規(guī)律分析，認(rèn)為抗性符合3∶1的分離規(guī)律，抗性受1對(duì)顯性基因控制。謝龍旭等[14]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法把抗草甘膦基因aroAM12導(dǎo)入棉花中，并對(duì)其抗性進(jìn)行了研究。劉錫娟等[15]把熒光假單胞菌種克隆的EPSPS基因轉(zhuǎn)入煙草和棉花中獲得抗草甘膦植株。趙福永等[16]成功地將抗草甘膦基因aroA-M1導(dǎo)入棉花中。此外，山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所與浙江大學(xué)等國(guó)內(nèi)單位合作，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法培育新型的抗草甘膦與抗蟲棉花也已經(jīng)取得巨大進(jìn)展。

同時(shí)，在玉米、水稻、大豆等作物中也有較多的研究報(bào)道。王秀君等[17]利用花粉管通道法把mG2-EPSPS基因?qū)胗衩鬃越幌抵校@得能耐受0.25%草甘膦藥液的抗性植株。蘇軍等[18]利用Error-prone PCR獲得的EPSPS酶突變基因轉(zhuǎn)入水稻中，并進(jìn)行了較詳細(xì)的抗性和農(nóng)藝性狀的調(diào)查研究。王曉波等[19]對(duì)外源抗草甘膦EPSPS基因在大豆基因組中的整合與定位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)中NOS下游的大豆基因組序列發(fā)生重排，導(dǎo)致一個(gè)編碼HEC1和HEAT的功能域基因結(jié)構(gòu)受到影響。除此之外，鄧力華等[20]利用EPSPS基因作為選擇性篩選標(biāo)記構(gòu)建了抗蟲表達(dá)載體，為其后續(xù)的轉(zhuǎn)基因作物篩選利用提供了多樣化。另外，卜貴軍等[21]研究了對(duì)大豆噴施草甘膦后，草甘膦對(duì)大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標(biāo)的影響。劉延等[22]對(duì)草甘膦噴施田旋花和打碗花后體內(nèi)草莽酸含量進(jìn)行了初步分析。

4 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性研究

目前，轉(zhuǎn)基因?qū)ι锇踩缘挠绊懕妒荜P(guān)注，但相關(guān)研究的結(jié)論性結(jié)果較少。其中，徐廣惠等[23]認(rèn)為，轉(zhuǎn)基因大豆在不同程度上降低了根際土壤細(xì)菌的數(shù)量和細(xì)菌群落的多樣性，并對(duì)根際土壤中Nitrospira屬細(xì)菌有一定的抑制作用。但抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆對(duì)節(jié)肢動(dòng)物群落多樣性無明顯影響[24]。而用含轉(zhuǎn)基因豆粕的飼料飼喂大鼠時(shí)，在胃、腸道內(nèi)容物中發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因豆粕的內(nèi)源基因和外源基因片段，但在其血液及各組織器官中則沒有發(fā)現(xiàn)[25]。另外，自然條件下人為加大蟲媒傳播（大于10頭/m2），抗草甘膦基因的花粉漂移概率接近0.05%，漂移距離為0.7 m[26]。此外，宋小玲等[27]以抗除草劑草甘膦和草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜為父本、諸葛菜為母本，在人工授粉條件下研究抗性基因向諸葛菜的潛在基因漂移，認(rèn)為抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向諸葛菜漂移的可能性較小。

目前，關(guān)于植物轉(zhuǎn)基因的安全性評(píng)價(jià)問題存在諸多爭(zhēng)論。國(guó)內(nèi)已有對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性的研究，但均屬初步探討，試驗(yàn)結(jié)果仍待探究。而毋庸置疑的是，轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對(duì)植物基因功能的研究具有極大幫助。在作物基因利用方面，我國(guó)棉花抗蟲性的成功對(duì)于棉花生產(chǎn)具有巨大促進(jìn)作用，但轉(zhuǎn)基因作物安全性仍將面臨諸多爭(zhēng)論與挑戰(zhàn)。

5 抗草甘膦基因?qū)＠c轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化競(jìng)爭(zhēng)

我國(guó)是草甘膦使用較多的國(guó)家，在與草甘膦相關(guān)抗性基因的研究方面雖然取得一定的進(jìn)展，但與國(guó)外相比差距仍然較大。宋敏等[28]對(duì)抗草甘膦基因EPSPS的專利保護(hù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，EPSPS的專利申請(qǐng)量迅速增加，且絕大部分專利由孟山都等跨國(guó)公司擁有；而我國(guó)目前申請(qǐng)的EPSPS基因?qū)＠鄬?duì)較少。在抗草甘膦轉(zhuǎn)基因棉花等作物的商業(yè)化方面，棉花、玉米、大豆、甜菜、馬鈴薯等多種抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物在美國(guó)、阿根廷、加拿大、巴西等國(guó)被批準(zhǔn)種植，中國(guó)也已批準(zhǔn)棉花、玉米、大豆、油菜的種植，但目前并沒有看到國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)或公司等在上述作物育種審定方面的報(bào)道。另外，相比國(guó)外公司或單位所申請(qǐng)的抗草甘膦轉(zhuǎn)基因作物種類種植許可可以看出，我國(guó)對(duì)抗草甘膦基因及其轉(zhuǎn)基因棉花等作物研究起步相對(duì)較遲，但近年來研究非常活躍，這與生產(chǎn)實(shí)際需要以及潛在的商業(yè)價(jià)值密切相關(guān)；無論如何，抗草甘膦或其他轉(zhuǎn)基因作物的研究已經(jīng)成為目前作物遺傳育種中重要的組成部分。

6 結(jié)語

到目前為止，世界上商業(yè)化的抗草甘膦棉花等作物的種植面積和種類在不斷增加?；谵D(zhuǎn)基因作物培育的競(jìng)爭(zhēng)趨勢(shì)，認(rèn)為當(dāng)前應(yīng)積極篩選新的有利用價(jià)值的抗草甘膦基因，并詳細(xì)闡明基因功能以及對(duì)其進(jìn)行知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)和開發(fā)利用，對(duì)我國(guó)培育具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的棉花等作物品種將會(huì)具有明顯的推動(dòng)作用。目前，我國(guó)通過轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)投入，極大地推動(dòng)了我國(guó)在轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的競(jìng)爭(zhēng)發(fā)展，而轉(zhuǎn)基因作物的研究發(fā)展將會(huì)更加廣泛。鑒于此種發(fā)展趨勢(shì)，科學(xué)地改進(jìn)目前轉(zhuǎn)基因的方法、嚴(yán)格界定轉(zhuǎn)基因作物利用目的和種類、積極培養(yǎng)高素質(zhì)科研人員以及規(guī)范轉(zhuǎn)基因法律法規(guī)等對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性都能夠起到一定的積極作用。此外，棉花生產(chǎn)在滿足我國(guó)不同消費(fèi)需求方面將會(huì)發(fā)揮重要作用，而安全利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)促進(jìn)我國(guó)棉花等作物的生產(chǎn)具有重要意義。

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