李 珂，趙 光綜述，高春芳，何偉華審校

動(dòng)物活體內(nèi)光學(xué)成像（optical in vivo imaging）主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)在活體動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行生物標(biāo)記，通過(guò)成像系統(tǒng)來(lái)監(jiān)測(cè)被標(biāo)記動(dòng)物體內(nèi)分子及細(xì)胞等的發(fā)展進(jìn)程，以及進(jìn)行相關(guān)的生物、藥物治療研究[1-3]。

目前，國(guó)內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成像的主要手段包括結(jié)構(gòu)成像（解剖成像）及功能成像 （分子成像）。以optical-imaging、micro-PET、micro-SPET為代表的動(dòng)物功能成像技術(shù)不但能即時(shí)反映活體動(dòng)物內(nèi)的細(xì)胞分布及基因表達(dá)，還能動(dòng)態(tài)觀察活體動(dòng)物體內(nèi)分子生物學(xué)過(guò)程，活體光學(xué)成像與micro-CT、MRI、ultrasound等結(jié)構(gòu)成像手段結(jié)合，能為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供更客觀的數(shù)據(jù)、更確切的分子生物特性。結(jié)合筆者所在醫(yī)院IVIS LuminaⅡ型活體成像設(shè)備 （living image）以及Living ImageSoftware分析軟件系統(tǒng)，對(duì)活體動(dòng)物光學(xué)成像技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 標(biāo)記腫瘤及抗腫瘤藥物

1.1 活體腫瘤標(biāo)記技術(shù) GFP綠色熒光蛋白、β2半乳糖苷酶(LacZ)、螢火蟲(chóng)熒光素酶（Luc）等是目前應(yīng)用較廣的動(dòng)物活體成像生物標(biāo)記。GFP綠色熒光蛋白受藍(lán)、紫光照射可自發(fā)地發(fā)出綠色熒光，其信號(hào)強(qiáng)度高，易于被捕獲，且GFP不需底物，對(duì)組織、細(xì)胞均無(wú)毒副作用，故在腫瘤生長(zhǎng)、藥效評(píng)價(jià)和基因治療等方面都得到了廣泛應(yīng)用。GFP的缺點(diǎn)在于發(fā)射波長(zhǎng)較短，穿透力稍差，對(duì)顯示深部腫瘤及微小病灶存在一定局限性。以L(fǎng)acZ、Luc標(biāo)記的細(xì)胞較GFP更適合于深部組織腫瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移微小病灶的研究?；铙w腫瘤標(biāo)記途徑有細(xì)胞轉(zhuǎn)染原位移植術(shù)、腫瘤細(xì)胞株尾靜脈注射法、致癌化學(xué)制劑腹腔注射、呼吸道吸入等。閆明霞等[4]報(bào)道的綠色熒光蛋白標(biāo)記的人肺癌皮下移植瘤模型主要通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染法建立人肺癌NCI-H460-GFP細(xì)胞系，接種至裸小鼠體內(nèi)建立皮下移植瘤模型，轉(zhuǎn)染率接近100%。李艷等[5]報(bào)道的活體動(dòng)物乳腺癌模型是通過(guò)脂質(zhì)體包裹帶有neo抗性基因及熒光素酶報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒PGL4.17[luc2/neo]，體外轉(zhuǎn)染人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，將獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的乳腺癌細(xì)胞株（MCF-7-luc）進(jìn)行皮下接種BAB-c裸鼠及尾靜脈接種SCID小鼠，建立BAB-c裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠尾靜脈移植瘤模型。國(guó)內(nèi)目前已建立有肺癌、乳腺癌、膀胱癌標(biāo)記的活體動(dòng)物模型，國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道還有肝癌、食管癌、胃癌等活體動(dòng)物模型[6-9]。

1.2 標(biāo)記抗腫瘤藥物 腫瘤早期，當(dāng)運(yùn)用解剖成像方法尚無(wú)法檢測(cè)到腫瘤病灶時(shí)，活體成像技術(shù)便可檢測(cè)到腫瘤發(fā)光信號(hào)，靈敏度較高。此外，解剖成像不能區(qū)分活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞，活體成像技術(shù)可檢測(cè)到腫瘤活細(xì)胞信號(hào)，且不顯示已經(jīng)凋亡的腫瘤細(xì)胞信號(hào)。在抗腫瘤藥物研究中，把標(biāo)記過(guò)的抗腫瘤藥物運(yùn)用在活體動(dòng)物體內(nèi)，給予已接種腫瘤的小鼠以不同治療方式、不同劑量、不同療程的抗腫瘤藥物。利用活體成像技術(shù)，在不同時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)觀察癌細(xì)胞在活體內(nèi)的生物學(xué)變化特點(diǎn)，觀察抗腫瘤藥物的最佳治療方式、劑量、給藥時(shí)間等，也可標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，間接觀察阻斷RNA對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷。

2 標(biāo)記、示蹤細(xì)胞

活體成像在標(biāo)記、示蹤細(xì)胞方面運(yùn)用了生物發(fā)光和熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光對(duì)標(biāo)記少量細(xì)胞（5～300個(gè)/視野）較敏感，熒光對(duì)標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量大于300個(gè)/視野較敏感。美國(guó)文獻(xiàn)報(bào)道的利用生物發(fā)光技術(shù)檢測(cè)到細(xì)胞數(shù)量最少可至3個(gè)/視野[10]。示蹤細(xì)胞指在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞存活狀態(tài)及分布走向進(jìn)行觀察，有報(bào)道可示蹤的細(xì)胞包括造血干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、CIK 細(xì)胞等[11，12]。

利用生物發(fā)光和熒光不但可以監(jiān)測(cè)到活體內(nèi)細(xì)胞增殖，還可監(jiān)測(cè)凋亡細(xì)胞事件[13]，如熒光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式存在時(shí)無(wú)熒光素酶活性，于體內(nèi)細(xì)胞不能發(fā)光，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，活化的caspase-3在特異識(shí)別位點(diǎn)切割去掉抑制蛋白，恢復(fù)熒光素酶活性就可產(chǎn)生發(fā)光。標(biāo)記凋亡細(xì)胞可用于包括AIDS、神經(jīng)退行性疾病、脊髓炎綜合征、缺血/再灌注損傷及腫瘤等細(xì)胞增殖-調(diào)亡的平衡被破壞而發(fā)生的一系列相關(guān)疾病的研究。

3 標(biāo)記免疫排斥

標(biāo)記免疫細(xì)胞的主要特點(diǎn)是觀察流體細(xì)胞在體內(nèi)的動(dòng)向和變化，常用于標(biāo)記T細(xì)胞、NK細(xì)胞等，也可以標(biāo)記干細(xì)胞及異體細(xì)胞，觀察干細(xì)胞演化和器官移植的研究。有報(bào)道，將熒光素酶標(biāo)記的造血干細(xì)胞移植入脾及骨髓，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞造血過(guò)程的早期事件及動(dòng)力學(xué)變化[14]。觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別、殺傷時(shí)可應(yīng)用帶有生物發(fā)光標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因小鼠淋巴細(xì)胞，檢測(cè)放化療的效果，尋找抗腫瘤免疫治療中復(fù)雜的細(xì)胞機(jī)制。

4 標(biāo)記細(xì)菌及病毒

利用細(xì)菌熒光素酶基因可以分別標(biāo)記革蘭陽(yáng)性和革蘭陰性細(xì)菌。用標(biāo)記好的細(xì)菌侵染活體動(dòng)物，觀測(cè)細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)的繁殖部位、數(shù)量變化及對(duì)外界因素的反應(yīng)，再通過(guò)活體動(dòng)物成像技術(shù)對(duì)已標(biāo)記細(xì)菌在活體內(nèi)對(duì)藥物的反應(yīng)進(jìn)行觀察，并對(duì)比實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)研究，篩選出藥物最佳劑量、給藥濃度及時(shí)間，還可觀察記錄藥物不同劑量對(duì)活體的毒副作用。其優(yōu)點(diǎn)主要有幾方面：①同一批老鼠持續(xù)觀察，避免個(gè)體間差異；②有更高的靈敏度，可以在感染早期就進(jìn)行活體觀察；③可以有結(jié)構(gòu)信息，在整體上觀察活體動(dòng)物的感染途徑；④可定量，以比較各個(gè)器官的感染程度。在標(biāo)記病毒方面，有報(bào)道用熒光素酶基因來(lái)標(biāo)記HSV-1病毒，可觀察到HSV-1病毒對(duì)肝臟、肺、脾及淋巴結(jié)的侵入和病毒從血液系統(tǒng)進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)程[15]。

5 標(biāo)記基因及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型

活體成像技術(shù)可以從影響基因表達(dá)的各個(gè)不同的層面進(jìn)行基因研究，可應(yīng)用于某種疾病的基因表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及基因治療等。在VEGFR2-Luc轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)標(biāo)記胚胎細(xì)胞[16，17]，在發(fā)育的過(guò)程可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)到小鼠體內(nèi)VEGFR2發(fā)光信號(hào)逐漸降低，至小鼠出生后VEGFR2表達(dá)的發(fā)光信號(hào)消失。同樣，研究者可根據(jù)研究方向，將靶基因、靶細(xì)胞、病毒及細(xì)菌進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記后轉(zhuǎn)入動(dòng)物體內(nèi)，形成研究所需的各種小動(dòng)物疾病模型，包括腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染疾病等。應(yīng)用于基因治療方面，可將一個(gè)或多個(gè)感興趣的基因及其產(chǎn)物安全而有效的傳遞到體內(nèi)靶細(xì)胞，再通過(guò)某種熒光素酶觀察目的基因是否在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)持續(xù)的特異性表達(dá)或是抑制，基因治療也是包括腫瘤等多種疾病綜合治療的一個(gè)新熱點(diǎn)、新領(lǐng)域。

綜上所述，LuminaⅡ活體成像儀技術(shù)優(yōu)勢(shì)包括：高靈敏度的CCD制冷鏡頭，最低溫度可達(dá)-90℃到-105℃，即使體內(nèi)發(fā)出很少的光子也能夠檢測(cè)到信號(hào)；自動(dòng)曝光系統(tǒng)（auto exposure time）能自動(dòng)檢測(cè)合適的曝光時(shí)間進(jìn)行成像來(lái)獲得最佳信號(hào)；光譜分離技術(shù)能過(guò)濾背景熒光顯示標(biāo)記熒光，可直接觀察活體動(dòng)物體內(nèi)的細(xì)胞凋亡；簡(jiǎn)易的XGI－8氣體麻醉系統(tǒng)能使動(dòng)物在成像過(guò)程中保持持續(xù)麻醉狀態(tài)，保證成像質(zhì)量且避免麻醉過(guò)深導(dǎo)致的動(dòng)物死亡。相對(duì)于其他非侵入性觀察手段，如Microsoft-PET、SPET，活體光學(xué)成像有靈敏度高、實(shí)驗(yàn)成本低廉等特點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用盡可能少的動(dòng)物數(shù)精確得到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

LuminaⅡ Living Image 4.0軟件分析系統(tǒng)，能無(wú)創(chuàng)的定量檢測(cè)小鼠原發(fā)瘤及轉(zhuǎn)移瘤，并對(duì)治療過(guò)程中腫瘤細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和定量評(píng)估，文獻(xiàn)報(bào)道光學(xué)成像對(duì)于微小腫瘤轉(zhuǎn)移灶 （少到100多個(gè)細(xì)胞）既可檢測(cè)到發(fā)光信號(hào)，較micro-CT、MRI、ultrasound 等結(jié)構(gòu)成像有更高的靈敏度[18]。 相對(duì)于傳統(tǒng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)，可以避免由于宰殺動(dòng)物而造成的組間差異，可以節(jié)省動(dòng)物的成本，可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤在體內(nèi)的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，使這些分子水平研究在更接近活體的環(huán)境中進(jìn)行，把分子生物學(xué)體外研究方法在體內(nèi)進(jìn)行實(shí)現(xiàn)。傳統(tǒng)腫瘤研究的方法主要局限于肉眼觀察、處死動(dòng)物后再進(jìn)行的腫瘤體積測(cè)量、組織學(xué)切片觀察等，無(wú)法動(dòng)態(tài)觀察整個(gè)腫瘤事件。

活體生物發(fā)光成像技術(shù)雖然是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)分子及細(xì)胞事件的強(qiáng)有力手段，但目前尚無(wú)法完成小分子藥物的標(biāo)記，且分辨率、體內(nèi)精確定位較差。所以，活體光學(xué)成像技術(shù)與結(jié)構(gòu)成像技術(shù)結(jié)合來(lái)提高分辨率、體內(nèi)精確定位等將是它的發(fā)展方向，也將為疾病在分子學(xué)水平的研究提供更廣闊的應(yīng)用空間。

[1]Rosenthal EI，Kullbersh BD，King T，et al.Use of fluorescent labeled anti-epidermal growth factor receptor antibody to image head and neck squamouse cell carcinoma a xenografts[J].Mol Cancer Ther，2007，6(4):1231-1238.

[2]Garcia T，Jacksin A，Bachelier R，et al.A convenient clinically relevant model of human breast cancer bone matastasis[J].Clin Exp Metastasis，2008，25(1):33-42.

[3]Tavazoie SF，Alarcon C，Oskarsson T，et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J].Nature，2008，451:147-152.

[4]閆明霞，劉 蕾，莢德水，等.人肺癌裸小鼠模型活體成像的動(dòng)態(tài)觀察[J]. 腫瘤，2008，28（10）：833-836.

[5]李 艷，張海燕.通過(guò)活體動(dòng)物光學(xué)成像系統(tǒng)建立乳腺癌動(dòng)物模型[J]. 腫瘤，2009，29（1）：76-80.

[6]Podetz-Pedersen KM，Bell JB，Steele TW，et al.Gene expression in lung and liver after intravenous infusion of polyethylenimine complexes of Sleeping Beautytransposons[J].Human Gene Therapy，2010，21(2):210-220.

[7]Man K，Ng KT，Xu A，et al.Suppression of liver tumor growth and metastasis by adiponectin in nude mice throughinhibition of tumor angiogenesis and downregulation of Rho kinase/IFN-inducible protein 10/matrixmetalloproteinase 9 signaling[J].Clin Cancer Res，2010，16(3):967-977.

[8]Kazuyoshi Yanagihara，Misato Takigahira，F(xiàn)umitaka Takeshita，et al.A photon counting technique for quantitatively evaluating progression of peritoneal tumor dissemination[J].Cancer Res，2006，66(15):7532-7539.

[9]Takaomi Okawa，Carmen Z.Michaylira，Jiri Kalabis，et al.The functional interplay between EGFRoverexpression，hTERT activation，and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development，invasion，and differentiation[J].Gene&Development，2007，21(24):2788-2803.

[10]Daadi MM，Davis AS，Arac A，et al.Human neural stem cell grafts modify microglial response and enhance axonal sprouting in neonatal hypoxic-ischemic brain injury[J].Journal of Cerebral Circulation，2010，41(3):516-523.

[11]Gondi CS，Veeravalli KK，Gorantla B，et al.Human umbilical cord blood stem cells show PDGF-D-dependent glioma cell tropism in vitro and in vivo[J].Neuro Oncol，2010，12(5):453-465.

[12]Hata N，Shinojima N，Gumin J，et al.Platelet-derived growth factor BB mediates the tropism of human mesenchymal stem cells for malignant gliomas[J].Neurosurgery，2010，66(1):144-156.

[13]Bharathi Laxman，Daniel E.Hall，Mahaveer Swaroop Bhojani，et al.Noninvasive real-time imaging of apoptosis[J].PNAS，2002，99(26):16551-16555.

[14]Alnawaz Rehemtulla，Neelam Taneja，Brian D.Ross bioluminescence detection of cells having stabilized p53 in response to a genotoxic event[J].Molecular Imaging，2004，3(1):63-68.

[15]Yu H，Liu ZT，Lv R，Zhang WQ.Antiviral activity of recornbinant cyanovirin-N against HSV-1[J].Virol Sin，2010，25(6):432-439.

[16]Cheng SJ，Lee CM，Kim EM，et al.Evaluation of therapeutic efficacy of a VEGFR2-blocking antibody using sodium-iodide symporter molecular imagine in a tumor xenograft model[J].Nucl Med Biol，2011，38(1):93-101.

[17]Yamanaka Y，Ralston A.Early embryonic cell fate dicisions in the mouse[J].Adv Exp Med Biol，2010，695（1）:1-13.

[18]Walther KA，Papke B，Sinn Mb，et al Precise measurement of protein interacting fractions with fluorescence lifetime imaging microscopy[J].Mol Biosyst，2011，10[Epub ahead of print].