張志勇 綜述,施橋發(fā) 審校

(1、江西省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006；2、南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)免疫學(xué)教研室，江西 南昌 330006)

乳頭狀瘤病毒首先于1907年在人類疣中發(fā)現(xiàn)，1983年Richard Shoppe 首先從兔中分離出乳頭狀瘤病毒。在19 世紀(jì)70年代前，子宮頸癌長期以來被認(rèn)為是一種性傳播因子引發(fā)的疾病[1]，直至1972年，德國科學(xué)家Zur Hansen 在對(duì)宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)因素探索研究的基礎(chǔ)上首次提出宮頸癌可能由HPV 感染引起，從而引起了學(xué)者對(duì)HPV的深入研究。近幾十年來的研究表明，高危型HPV 從腫瘤的啟動(dòng)、發(fā)生、發(fā)展及惡性表形的全過程都密切相關(guān)，是與人類腫瘤關(guān)系最為密切的腫瘤病毒。本文就其最新的研究進(jìn)展作一綜述。

1 生物學(xué)特性

1.1 HPV的分子生物學(xué)特性 乳頭瘤病毒(papilloma virus,PV)是一組無包膜的小DNA 病毒，屬乳頭瘤病毒科，可感染人和多種高級(jí)脊椎動(dòng)物的皮膚及黏膜上皮組織，其中感染人類的稱為人乳頭瘤病毒(Human pap;lilloma virus,HPV)。HPV 通常為直徑52～60nm的正十二面體結(jié)構(gòu)，病毒顆粒含有一條約8kb 堿基對(duì)雙鏈DNA,外包以病毒衣殼。所有的HPV 基因組均有8個(gè)開放讀碼框架，8個(gè)開放讀碼框架僅從一條DNA 上譯碼，HPV 基因組從功能上分為三部分：(1)早期區(qū)，編碼E1-E7 蛋白，是病毒復(fù)制的必需部分；(2)晚期區(qū)，編碼L1和L2 蛋白，是病毒組裝所必需部分；(3)長調(diào)控區(qū)(LCR)，其中包括病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄所需要的多個(gè)cis 元件。

1.2 HPV的分型 訖今為止，已分離出不同基因型的HPV 達(dá)100個(gè)以上，其中超過40種可以感染肛門、生殖道或其他部位的內(nèi)皮或黏膜上皮。根據(jù)HPV與誘發(fā)上皮組織增生的惡性程度不同，可以將其分為低危型HPV，包括HPV6、11、42、43等，通常引起生殖器濕疣、尖銳濕疣和非惡性病變[2]，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等類型，通常引起重度非典型性增生與宮頸癌。但大多數(shù)情況下，機(jī)體的免疫系統(tǒng)能在HPV 感染引發(fā)腫瘤之前將其清除[3]，僅有少部分高危型HPV 感染者發(fā)展成惡性腫瘤。

2 HPV 感染的流行病學(xué)情況

有關(guān)HPV 感染率的研究，由于檢測標(biāo)本的來源、使用的HPV 檢測技術(shù)、檢測的HPV型別及研究地區(qū)人群的不同，各研究的HPV 感染陽性率各有不同。美國2006年調(diào)查顯示，美國有2 千萬HPV 感染者，每年新發(fā)感染有62萬[4]，其中女性比男性要高2倍。WHO/IARC 于2004年至2005年在我國對(duì)不同地區(qū)3000個(gè)不同年齡段的婦女進(jìn)行的HPV 患病率調(diào)查顯示[5-7]，中國婦女HPV 感染率在15%以上。

HPV 感染一般來說是通過生殖道接觸傳播。影響HPV 感染率的因素有多種，性行為是最主要因素，有研究顯示有多個(gè)性伴侶的人在其一生中HPV 感染率為20.1%，同時(shí)只有一個(gè)性伴侶的人群感染率為7%[8],其他包括吸煙、長期使用激素類避孕藥和性病史也是影響HPV 感染率的重要因素[9，10]。研究表明，大約有90%的HPV 陽性組織在2年內(nèi)轉(zhuǎn)為陰性[11]，10%以下的感染個(gè)體的宮頸上皮出現(xiàn)異常增生，但大多數(shù)處于平穩(wěn)期。雖然大部分婦女在其一生中都至少感染一種HPV 亞型，但是這些感染人群患子宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)有多高目前尚不清楚，它取決于個(gè)體感染HPV的型別及機(jī)體的免疫功能。人乳頭狀瘤病毒不僅影響到婦女，甚至感染男性。HPV也能在男性之間進(jìn)行傳播，有文獻(xiàn)報(bào)道，男同性戀者中肛門HPV 感染率高，發(fā)生HPV相關(guān)肛門癌的危險(xiǎn)性也高[12]，但以收集男性標(biāo)本做HPV-DNA的敏感方法最近才得到發(fā)展，所以對(duì)于男性HPV的感染因素及其自然史，目前還缺少相關(guān)資料。

3 HPV 致子宮頸癌的主要機(jī)制

自Zur Hansen 在子宮頸癌患者中發(fā)現(xiàn)HPV16和HPV18 以來，世界各國科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)除HPV16和HPV18外，另有HPV31、HPV34等14種型別的HPV可在人的生殖器、鼻咽部、食道等部位引發(fā)惡性腫瘤，并在其惡性腫瘤組織中檢測出較高的HPV 感染率，并且存在與導(dǎo)致宮頸癌相似的致癌機(jī)制[13]。

對(duì)高危性HPV 如何引起子宮的惡性變化最終誘發(fā)子宮頸癌這一課題，科學(xué)家利用分子生物學(xué)、免疫學(xué)和遺傳學(xué)的技術(shù)方法進(jìn)行了深入的研究。在體內(nèi)和體外研究均表明，HPV與宮頸癌的關(guān)系最重要三個(gè)致癌基因?yàn)镋5、E6、E7[14]。E5 蛋白能與多種細(xì)胞生長因子受體結(jié)合，通過活化多種細(xì)胞因子的受體信號(hào)通路刺激細(xì)胞增殖[15],它對(duì)于病毒的DNA 整合到宿主基因組這一個(gè)腫瘤啟動(dòng)的關(guān)鍵步驟發(fā)揮了重要作用。E6 蛋白通過E6-AP的介導(dǎo)與P53 抑癌基因蛋白結(jié)合，在E6-Ap-ubiquitin蛋白酶的作用下，促使P53 蛋白進(jìn)入泛素依賴的降解途徑，改變G1期進(jìn)入S期的調(diào)控點(diǎn)，細(xì)胞進(jìn)入S期，導(dǎo)致突變?cè)黾?、DNA的完整性受損。而且P53的降解還導(dǎo)致抑癌基因的功能降低，同時(shí)啟動(dòng)細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡。E6 還作用于其他蛋白，包括點(diǎn)狀粘蛋白paxillin和干擾素調(diào)節(jié)因子3，E6蛋白與干擾素的作用阻斷了病毒對(duì)INF-β 誘導(dǎo)作用[16]。E6 還可使惡變的細(xì)胞對(duì)于TNF-α 介導(dǎo)的AP 復(fù)合物的改變不產(chǎn)生反應(yīng)[17]。而E7 蛋白則與細(xì)胞RB 基因蛋白及其相關(guān)蛋白的相互作用，隨繼從RB 基因復(fù)合物釋放出EF2 轉(zhuǎn)錄激活因子，E2F可與DNA 結(jié)合，活化促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞過度增殖，最終導(dǎo)致細(xì)胞的永生化或腫瘤的發(fā)生[18，19]。總之，HPV與宿主基因整合、HPV 對(duì)細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的影響、原癌基因和端粒酶的活化，被認(rèn)為是HPV 誘發(fā)子宮頸癌變的關(guān)鍵因素。

4 HPV的檢測方法

研究表明，99.7%的浸潤型宮頸癌中可檢測到HPV的存在[20]。HPV 檢測對(duì)宮頸癌的診斷與預(yù)防有著重要意義，目前在醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室已開展多種實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目對(duì)HPV 進(jìn)行檢測，其常用檢測方法如下。

4.1 巴氏涂片細(xì)胞病理學(xué)檢測

凹空細(xì)胞是HPV 感染的主要形態(tài)學(xué)改變，在宮頸移行區(qū)取材進(jìn)行巴氏染色可見由HPV 引起的凹空細(xì)胞，即可診斷。近年來隨著技術(shù)的進(jìn)步，傳統(tǒng)的巴氏涂片法發(fā)展為液基薄層細(xì)胞技術(shù)(Thinprep cytologic test，TCT)和涂片自動(dòng)檢測系統(tǒng)[21]。TCT 操作標(biāo)準(zhǔn)化，人為影響因素較少，其檢測的準(zhǔn)確度高于傳統(tǒng)的巴氏涂片法，目前在臨床上已規(guī)模用于普查和篩查[22]，但由于其他病毒感染和人為因素均可造成細(xì)胞內(nèi)凹空性變，加之取材、染色以及人為主觀判斷的影響，TCT 法檢測HPV 仍存在靈敏度較低、特異性不高的缺點(diǎn)，此外也不能進(jìn)行HPV 分型。

4.2 分子生物學(xué)法

4.2.1 PCR 檢測HPV-DNA 以基因擴(kuò)增為基礎(chǔ)檢測HPV-DNA，是目前靈敏度最高的檢測方法。PCR 不僅可以應(yīng)用于檢測病毒負(fù)荷定量、DNA 測序、突變分析，還可用于多重?cái)U(kuò)增，同時(shí)檢測多個(gè)DNA 序列。PCR 具有操作簡單，標(biāo)本來源不受限制等特點(diǎn)，因此PCR 檢測是目前進(jìn)行HPV-DNA 檢測及分型的最好辦法[23]。但是高靈敏性導(dǎo)致它容易由于標(biāo)本的污染而導(dǎo)致假陽性結(jié)果，而且在進(jìn)行HPV 分型時(shí)一次性檢測的樣本數(shù)目有限，限制了其在大規(guī)模篩查中的應(yīng)用。PCR 法包括型特異性PCR 檢測、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(FQ-PCR)、通用引物PCR 檢測等。

4.2.2 PCR 產(chǎn)物分型檢測 通用引物PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物可用直接測序法、限制片段長度多態(tài)性分析(RFLP)、雜交分析、基因芯片實(shí)現(xiàn)基因分型。直接測序法是HPV 檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，能檢測到所有的型別，并可避免雜交反應(yīng)所固有的交叉反應(yīng)，對(duì)檢測出新發(fā)現(xiàn)的型別有著重要作用，但是混合感染時(shí)，可能一種型別占絕對(duì)優(yōu)勢，這就無法辨別出含量少的型別，造成假陰性，將混合型判定為單一型[24]。RFLP 是選擇合適的限制性核酸內(nèi)切酶，并根據(jù)特定的酶切條帶模式判斷HPV型別。雜交分析是最常用的檢測PCR 產(chǎn)物的方法。雜交法敏感度高，并對(duì)多重感染的檢測能力較高，可以判斷HPV的多重感染及型別，目前常用于HPV型別分布的統(tǒng)計(jì)中[25]。但其缺點(diǎn)是只能用于檢測已知的某些常見型別，對(duì)未知型別及變異型的HPV 不能檢測,而且不能排除交叉雜交的可能性?；蛐酒遣捎迷缓铣苫蝻@微點(diǎn)樣技術(shù)將DNA 探針固化于支持物表面，產(chǎn)生二維DNA 探針陣列，然后與標(biāo)記的樣本進(jìn)行雜交，通過檢測雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)快速、高效的檢測?；蛐酒s交可實(shí)現(xiàn)一次性對(duì)大批量標(biāo)本進(jìn)行檢測分析，具有通量高、速度快、信息量大、所需樣本少、污染少等特點(diǎn)。研究顯示基因芯片的靈敏度和特異性較其他方法高，其敏感性高達(dá)96.0%[26]。但目前基因芯片技術(shù)的成本昂貴，如在將來能降低其技術(shù)成本，將有廣闊的發(fā)展前景。

4.2.3 雜交捕獲法 雜交捕獲法是利用兩套全長RNA 探針與HPV 核酸雜交，再通過抗體捕獲信號(hào)的放大和化學(xué)發(fā)光信號(hào)的檢測，來確定HPV 存在與否。根據(jù)此法，美國Digene 公司先后開發(fā)出HCⅠ、HCⅡ、HCⅢ、HC Express Array等幾代產(chǎn)品，其中HCⅡ是通過化學(xué)熒光法來定量檢測病毒DNA，可同時(shí)檢測13種高危型和5種低危型HPV型別，該技術(shù)敏感性好、重復(fù)性高，是目前唯一通過FDA批準(zhǔn)的可在臨床使用的HPV 檢測技術(shù)[27]，但缺點(diǎn)是不能進(jìn)行HPV 分型。HCⅢ用一段帶有生物素的寡核苷酸代替HCⅡ中的特異性抗體，減少了非特異性造成的假陽性結(jié)果,但也不能進(jìn)行HPV 分型。HC Express Array 技術(shù)則利用芯片上固定病毒不同亞型的特異性DNA 探針，對(duì)病毒DNA 進(jìn)行分型判斷，具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 免疫學(xué)檢測 主要是利用經(jīng)重組技術(shù)表達(dá)的抗原來檢測患者血清中相應(yīng)的抗體，或抗原免疫動(dòng)物制備免疫血清，或單克隆抗體檢測組織或局部黏液中HPV 抗原。臨床常用免疫吸附法檢測HPV 中L1 類病毒顆粒的IgM和IgG 抗體以及HPV的E6、E7的特異性抗體蛋白等。另外也可利用免疫組織化學(xué)法檢測高危型HPV的早期基因蛋白E6、E7，早期基因蛋白的存在能有效的證明組織中存在HPV 感染。但由于血清學(xué)檢測的對(duì)象是抗原和抗體，人體對(duì)HPV 感染產(chǎn)生免疫應(yīng)答有一定的遲滯性，同時(shí)HPV 病毒不能在體外培養(yǎng)增殖，所以血清學(xué)檢測對(duì)無免疫應(yīng)答者和HPV 潛伏期感染者會(huì)產(chǎn)生漏檢。

4.4 多種檢測方法的聯(lián)合應(yīng)用 單一方法檢測均有缺點(diǎn)，臨床多采用聯(lián)合多種檢測方法以提高準(zhǔn)確性。高娜等[28]研究發(fā)現(xiàn)，將HPV-DNA 檢測和細(xì)胞學(xué)檢查聯(lián)合應(yīng)用進(jìn)行宮頸癌及CIN的篩查，其效率大為提高。而在篩查宮頸癌的最佳方案中，HCⅡ與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測是最佳方案[29]。

5 HPV 疫苗

5.1 HPV 疫苗的分型 HPV 疫苗可分為預(yù)防性和治療性兩種類型。HPV 預(yù)防性疫苗可阻斷HPV 感染皮膚和黏膜，一般由病毒衣殼蛋白L1 或L1+L2組成，在細(xì)胞內(nèi)可自我組裝成空心病毒樣顆粒(VLPs)[30]，它具有與完整病毒相同的抗原空間表位，可激發(fā)機(jī)體的CD4+淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體。預(yù)防型疫苗種類較少，主要以HPV 病毒的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)形式存在，其不含病毒DNA和癌蛋白，因而具有較高的免疫原性和安全性。隨機(jī)臨床試驗(yàn)顯示，預(yù)防性HPV 疫苗對(duì)治療HPV 感染是有效的[31,32]。

HPV治療性疫苗可清除由HPV 感染所引起的腫瘤殘存病灶、宮頸不典型增生(CIN)及生殖器尖銳濕疣，阻斷低危型病變向高危型病變及癌癥的轉(zhuǎn)變過程。治療疫苗多將E6和E7 蛋白作為靶抗原，理想的治療性疫苗可以使機(jī)體產(chǎn)生HPV 特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)。目前研究的治療性疫苗主要有重組牛痘病毒疫苗、a 病毒載體疫苗、腺病毒載體疫苗、細(xì)菌載體疫苗、基因疫苗、肽段疫苗、p16INK4a 疫苗、融合蛋白疫苗和細(xì)胞疫苗等。

5.2 HPV 疫苗的現(xiàn)況 目前，應(yīng)用較為廣泛的HPV疫苗主要是預(yù)防性疫苗，主要有2種[33]：一種是美國默克公司生產(chǎn)的針對(duì)HPV 6型、11型、16型、18型的四價(jià)疫苗Gardasil，另一種是葛蘭素史克公司生產(chǎn)的針對(duì)16型和18型二價(jià)體疫苗Cervarix，二者分別于2006年6月和2009年10月通過美國FDA的批準(zhǔn)。疫苗最佳注射時(shí)間是在首次性生活之前，兩種疫苗最早可接種年齡為9歲，疫苗的有效期在5年以上，臨床試驗(yàn)結(jié)果證明其均有良好的耐受性，且沒有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，抗體效價(jià)比自然感染HPV的患者高50倍[34，35]。

5.3 HPV 疫苗存在的問題及展望近幾十年來，人們?cè)趯m頸癌發(fā)病機(jī)制以及宮頸癌預(yù)防和治療方面取得了很大的進(jìn)展，HPV 疫苗的發(fā)明為通過接種預(yù)防宮頸癌提供了可能。預(yù)防性HPV 疫苗Gardasil和Cervarix 在一些國家和地區(qū)得到了較為廣泛的應(yīng)用，但在某些國家和地區(qū)針對(duì)是否將其納入常規(guī)接種計(jì)劃尚有爭議。預(yù)防性HPV 疫苗在預(yù)防HPV 感染和CIN 方面有高效性，在安全性方面在一定程度上也可得到保證。但HPV 預(yù)防性疫苗只能預(yù)防疫苗亞型范圍內(nèi)的HPV 感染，對(duì)疫苗范圍外的亞型感染沒有保護(hù)作用，對(duì)已經(jīng)感染此種HPV 亞型的女性也沒有保護(hù)作用。在我們國家，宮頸癌的發(fā)生率相對(duì)較高,引起宮頸癌最常見的高危亞型是52、58型，目前國際上市的兩種HPV 疫苗均未針對(duì)其，因此相應(yīng)的HPV 疫苗也沒有在國內(nèi)上市，我們?nèi)匀恍枰ㄟ^篩查來盡早發(fā)現(xiàn)宮頸病變。盡管目前疫苗存在一些問題，但是隨著該領(lǐng)域研究的發(fā)展，問題終將得到解決。

綜上所述，HPV與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)防和治療都有密不可分的關(guān)系。針對(duì)目前研究中存在的問題，我們應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)HPV 感染與宮頸癌關(guān)系的研究，研制出針對(duì)性的人乳頭狀瘤病毒疫苗，使人類最終免受宮頸癌及其它HPV 相關(guān)疾病的危害。

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