于麗娟，丁 斐，葉 輝*

（南通大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南通 226019）

麥曲作為黃酒發(fā)酵的糖化劑，含有大量能分泌淀粉糖化酶的微生物[1]，糖化酶能將淀粉水解為葡萄糖，進(jìn)而被微生物發(fā)酵，生產(chǎn)酒精。糖化酶活力高，原料利用率就高，因此篩選高產(chǎn)糖化酶菌株對(duì)釀酒工業(yè)具有重要意義。本研究從不同麥曲中分離篩選高產(chǎn)淀粉糖化酶菌株，依據(jù)形態(tài)特征和ITS序列分析對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定，并研究了粗酶的酶學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮）200g，葡萄糖20g，水1000mL，瓊脂20g，自然pH值，121℃濕熱滅菌20min。

選擇性平板培養(yǎng)基（產(chǎn)透明圈）：可溶性淀粉2g，蛋白胨0.5g，瓊脂20g，氯化鈣0.4g，磷酸氫二鈉0.8g，自然pH值；水1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

固體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基[2]：麩皮8g，玉米粉1g，大豆粉1g，鹽溶液10mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min（鹽溶液：K2HPO42%，（NH4）2SO44%）。

1.2 菌株篩選

初篩：取粉碎好的麥曲10g，裝入帶玻璃珠的90mL無(wú)菌水的三角瓶中，搖晃打散，使麥曲中的微生物形成懸浮液，用無(wú)菌移液管對(duì)懸浮液進(jìn)行稀釋，稀釋至10-1～10-6。吸取各種稀釋度溶液0.1mL涂布于選擇性培養(yǎng)基平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d，取出培養(yǎng)皿，滴加盧戈氏碘液，測(cè)量透明圈直徑D和菌株直徑d。挑取D/d較大的菌株接種斜面保藏。

復(fù)篩：無(wú)菌水洗出孢子，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度，接種于固體培養(yǎng)基中?；靹蚝螅?0℃培養(yǎng)72h，培養(yǎng)期間每隔一段時(shí)間搖動(dòng)一次。培養(yǎng)結(jié)束后，加入50mL蒸餾水并將固體培養(yǎng)基搗碎，40℃水浴1h，取出粗酶液8000r/min離心5min，棄沉淀得粗酶液，測(cè)定淀粉糖化酶活力。

淀粉糖化酶活力測(cè)定采用碘量法[3]。酶活力單位定義為1mL酶液，于40℃、pH 4.6的條件下，1h分解可溶性淀粉產(chǎn)生1mg葡萄糖，即為1個(gè)酶活力單位，以U/g（U/mL）表示。

1.3 菌株DNA的提取及PCR擴(kuò)增

采用北京索萊寶科技有限公司的真菌基因組提取試劑盒提取純株真菌的基因組DNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR擴(kuò)增參照方華等[4-5]的方法。

1.4 酶學(xué)特性研究

1.4.1 反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響以及酶的熱穩(wěn)定性研究

在自然pH值條件下，將酶液和淀粉混合液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴鍋中水解30min，測(cè)定酶活力，考察溫度對(duì)酶活的影響。將酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃水浴鍋中加熱30min，然后再加入淀粉溶液，在40℃測(cè)定殘余酶活力，考察溫度穩(wěn)定性。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4.2 反應(yīng)pH值對(duì)酶活性的影響以及酶的pH值穩(wěn)定性

配制pH值不同的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0，在40℃分別測(cè)定酶活力，考察pH值對(duì)酶活的影響。將酶液置于不同pH值的緩沖液中30min，然后再加入淀粉溶液，40℃酶解30min，測(cè)定酶活。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4.3 金屬離子對(duì)淀粉酶活性的影響

在反應(yīng)體系中分別加入1mL濃度為1mmol/L的各種金屬離子，研究金屬離子對(duì)淀粉酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

滴加盧戈氏碘液后，靜置30min。觀察培養(yǎng)皿中有無(wú)透明圈，若有，測(cè)量菌株直徑d和透明圈直徑D，挑選D/d較大的菌株進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩結(jié)果見表1，其中菌株A17糖化酶活力最高。

2.2 菌株A17的形態(tài)特征

菌株A17的菌落形態(tài)和鏡檢形態(tài)見圖1。

A17的菌落形態(tài)：菌落生長(zhǎng)快，10d直徑達(dá)5cm～6cm，質(zhì)地疏松，初白色、黃色，后變?yōu)楹稚恋G褐色。背面無(wú)色。在含0.05%茴香醛的察氏培養(yǎng)基上，分生孢子呈現(xiàn)紅色。

表1 菌株復(fù)篩結(jié)果Table 1 Strains rescreening results

圖1 菌株A17的形態(tài)Fig.1 The morphological observation of strain A17

A17的鏡檢形態(tài)：分生孢子頭放射狀，直徑150μm～300μm。分生孢子梗2mm左右，無(wú)隔膜。頂囊近球形，分生孢子卵圓形或近球形。

2.3 菌株A17的ITS（internal transcribed spacer）序列PCR擴(kuò)增結(jié)果分析

圖2 菌株A17的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（數(shù)字表示與相鄰菌屬的同源性百分?jǐn)?shù)）Fig.2 Phylogenic tree of strain A17 and related species based on ITS sequences (Bootstrap values were indicated as percentage to all branches)

將菌株A17的ITS序列結(jié)果通過(guò)Blast程序與Genbank中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結(jié)果表明，菌株A17的ITS序列和曲霉菌的結(jié)構(gòu)相似，結(jié)合其形態(tài)特性（圖1）和ITS序列比對(duì)結(jié)果，初步鑒定菌株A17為米曲霉。

2.4 酶學(xué)特性研究

2.4.1 溫度對(duì)酶活力的影響及酶的熱穩(wěn)定性

溫度對(duì)酶活力及酶熱穩(wěn)定性的影響見圖3。在30℃～60℃時(shí)，隨著溫度升高，酶活力逐漸增大，60℃后，該酶蛋白由于高溫部分失活，活力下降，因此，該酶的最適溫度為60℃。由酶的熱穩(wěn)定性曲線可知，酶在30℃～55℃較穩(wěn)定，相對(duì)酶活力保持在80%以上，當(dāng)溫度升高為60℃時(shí)酶活迅速下降為40%左右，因此，該酶的熱穩(wěn)定范圍為30℃～55℃。

圖3 溫度對(duì)酶活力及酶穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activity and stability

2.4.2 pH值對(duì)酶活力的影響及酶的pH值穩(wěn)定性

pH值對(duì)酶活力的影響及酶的pH值穩(wěn)定性見圖4。由圖4可知，該酶在pH 3～7都具有較高的活力，pH4.0時(shí)達(dá)最大，因此，該糖化酶的最適pH值為4.0，為一酸性淀粉糖化酶。酶液在不同pH值緩沖溶液中處理30min后，在pH 4～5之間比較穩(wěn)定，保持80%以上的酶活性。

圖4 pH值對(duì)酶活力及酶穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of pH value on the enzyme activity and stability

2.4.3 金屬離子對(duì)淀粉酶活性的影響

各金屬離子對(duì)酶活力的影響見表2。Mg2+、Ca2+對(duì)該酶有一定的激活作用，F(xiàn)e3+、Mn2+、Cu2+對(duì)該酶有較強(qiáng)的抑制作用。

表2 不同金屬離子對(duì)酶活性的影響Table 2 The effect of different metal ions on the enzyme activity

3 結(jié)論

糖化酶的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，特別是在食品生產(chǎn)行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。如糖化酶的應(yīng)用使糧醅入酵后發(fā)酵升溫快、幅度大，提高原料的出酒率，可縮短發(fā)酵周期[6-7]；在食用醋生產(chǎn)中，應(yīng)用糖化酶可以解決企業(yè)自制酒母質(zhì)量不穩(wěn)定和夏季高溫等生產(chǎn)難題，使食用醋生產(chǎn)正常進(jìn)行[14]。本研究以透明圈平板初篩，固態(tài)發(fā)酵測(cè)酶活復(fù)篩的方法從黃酒麥曲中篩選到一株產(chǎn)糖化酶活力較高的菌株A17，經(jīng)鑒定為米曲霉。將菌株A17進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵后，酶活力可達(dá)1835U/g干曲。對(duì)該酶酶學(xué)性質(zhì)的初步研究表明，該酶的最適作用溫度為60℃，最適作用pH 值為4，Ca2+、Mg2+對(duì)酶有一定的激活作用，而其他Fe3+、Mn2+、Cu2+有較強(qiáng)的抑制作用。該酶與其他中溫酸性淀粉酶比較，具有溫度耐受性好、耐酸性、產(chǎn)酶能力高的優(yōu)勢(shì)，是一種典型的中溫酸性淀粉酶，具有較大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。

[1]汪建國(guó).傳統(tǒng)麥曲在黃酒釀造中的作用和特色[J].中國(guó)釀造，2004（10）：29-31.

[2]鐘 浩.黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶的研究[J].中國(guó)釀造，2009（1）：26-29.

[3]方 華.紹興黃酒麥曲中微生物的初步研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006.

[4]方華曹，陸 健，謝廣發(fā).黃酒麥曲中主要霉菌的分子鑒定及分類[J].釀酒科技，2006（3）：45-47.

[5]白樹猛，田 黎.ITS 序列分析在真菌分類鑒定和分子檢測(cè)中的應(yīng)用[J].畜牧與飼料科學(xué)，2009，30（1）：52-53.

[6]彭 燕.活性干酵母輔以糖化酶在混蒸混燒工藝中的試用[J].釀酒，2006，33（3）：78-80.

[7]趙金松，羅惠波，吳士業(yè).糖化酶在清香型小曲酒生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].食品科技，2006（3）：94-95.