竇金金，謝寧，吳頌，史瑞，張真

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生學院，哈爾濱150040;2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院急癥部)

改良2-血管阻斷法(2-VO)+硝普鈉降壓是血管性癡呆(VD)研究中常用的模型之一［1］。此法制作模型可重復性、穩(wěn)定性較好，其優(yōu)點為手術(shù)操作簡單，對動物創(chuàng)傷較小，易于恢復，尤其是以學習記憶能力低下為主要特點，與臨床“血管性癡呆”的發(fā)病過程相似，存活率較高。適用于研究血管性癡呆的病理生理機制和評價藥物的作用。傳統(tǒng)方法分離雙側(cè)頸總動脈，腹腔注射硝普鈉造成低血壓，夾閉雙側(cè)頸總動脈10 min，再通10 min，如此反復2次，撤線，縫合傷口。本文擬對傳統(tǒng)方法進行改良，探討延長雙側(cè)頸動脈夾閉時間并增加夾閉次數(shù)建立VD模型的成功率。

1 材料和方法

1.1 模型的復制 將購買的雄性Wistar大鼠(由本校實驗動物室提供)20只，體質(zhì)量220～250 g，適應性飼養(yǎng)2周后，隨機分為腦缺血模型組、假手術(shù)對照組，每組10只。各組大鼠手術(shù)前后均常規(guī)飼養(yǎng)。將大鼠用10%烏拉坦(1 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，仰臥固定在手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈(CCA)，模型組在夾閉雙側(cè)CCA之前，腹腔注射硝普鈉(北京雙鶴制藥廠，2.5 mg/kg，用無菌蒸餾水溶解)，隨即用無創(chuàng)動脈夾夾閉雙側(cè)CCA，20 min 后，再通 10 min，再夾閉 20 min，再通10 min，再夾閉20 min再通后縫合傷口，術(shù)后于頸動脈傷口處均勻撒入青霉素鈉鹽。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程與模型組相同，但不阻斷CCA及注射硝普鈉。在全部造模過程中保持動物直腸溫度在37℃左右，以防止低溫對腦缺血損傷的保護作用。

1.2 行為學測定 術(shù)后觀察大鼠一般情況及成活率，于術(shù)后28 d使用Morris水迷宮對大鼠進行學習記憶能力的測定［2］。

定位航行試驗:在水池里注入清水，使水面高出平臺1～2 cm，水溫控制在(24±2)℃左右，水池等分為4個象限(從右上、左上、左下、右下分別是一至四象限)。將平臺放在第四象限中間，在其他三個象限任選一點面向水池池壁將鼠放入水中，試驗歷時4 d，每天上午每個象限各測試1次，每次測試1 min。若大鼠在1 min之內(nèi)尚未找到平臺，則將鼠拿到平臺上并使它在上面站10 s，則其潛伏期為1 min;若鼠在1 min之內(nèi)找到平臺，也讓其在平臺上站10 s，方結(jié)束一次訓練，如此訓練4 d。記錄大鼠分別在三個象限找到平臺所需時間(即潛伏期)，計算平均值。

空間探索試驗:在行為學測試第5天下午，定位航行試驗結(jié)束后，撤除平臺，然后從原始平臺對側(cè)象限入水點將大鼠放入水中，測其1 min內(nèi)經(jīng)過原始平臺位置的次數(shù)以及平臺象限游程占總游程的百分比。

1.3 形態(tài)學觀察 行為學測試完成后，斷頭處死動物，取腦組織固定，取視交叉后4 mm處至小腦前的腦組織，然后做Nissl染色，光鏡觀察海馬細胞形態(tài)變化。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS10.0軟件，數(shù)據(jù)分析運用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 基本情況 1周內(nèi)體質(zhì)量明顯減輕，活動減少，飲食差，毛發(fā)蓬松且易脫落。手術(shù)28 d后，模型組存活9只，存活率與正常組差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 行為學指標 在Morris水迷宮實驗中，模型組路徑比正常組明顯延長，潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)明顯減少、平臺象限游程占總游程的百分比也顯著降低，見表1，2。

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實驗結(jié)果(±s，m)

表1 兩組大鼠水迷宮定位航行實驗結(jié)果(±s，m)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(shù)(只) 第1天 第2天 第3天 第4天對照組 10 25.39 ±5.92 21.52 ±7.04 17.08 ±3.97 10.72 ±4.80模型組 9 48.59 ±6.27a45.92 ±8.01a41.12 ±5.80a35.65 ±4.37a

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實驗結(jié)果(±s)

表2 兩組大鼠水迷宮空間探索實驗結(jié)果(±s)

注:與對照組比較，aP＜0.01

組別 鼠數(shù)(只) 穿越平臺次數(shù)平臺象限游程占總游程的百分比(%)對照組10 6.62 ±2.23 39.47 ±8.07模型組 9 3.50 ±1.61a 26.45 ±4.31a

2.3 病理學變化 光鏡下觀察:對照組海馬CA1區(qū)錐體細胞排列緊密有序，細胞核圓而大，邊界及核仁清晰，胞漿內(nèi)尼氏體豐富，而且均勻分布，神經(jīng)纖維排列整齊;模型組海馬CA1區(qū)錐體細胞大小排列紊亂、稀疏，細胞間隙增大，胞漿內(nèi)尼氏體減少或消失，有數(shù)量不等的小空泡，呈均勻淡藍色，細胞核變小，結(jié)構(gòu)不清，核仁消失，神經(jīng)纖維排列紊亂，神經(jīng)元脫失現(xiàn)象明顯。

3 討論

VD是由一系列腦血管因素導致腦組織損害引起的癡呆綜合征?；颊弑憩F(xiàn)為記憶及認知等功能障礙綜合征，不僅嚴重損害患者的健康，影響患者的生命質(zhì)量，也給家庭和社會帶來沉重的負擔［3-4］。在我國11個城市流行病學調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，60歲以上人群中VD的患病率為324/10萬人口，老年性癡呆(AD)為238/10萬人口，VD占各類癡呆的第1位。VD患者的平均生存時間為41個月，5年內(nèi)死亡率達60%以上［5］。并且隨著人類社會的老齡化，VD已是國內(nèi)外醫(yī)學界研究的重要課題，由于對本病的發(fā)病機制尚不十分明確，亦缺少治療本病的特效藥物，因此建立理想的VD動物模型對于探明VD的病因、病理過程以及尋找和篩選防治藥物具有重要意義。

我們通過實驗發(fā)現(xiàn)只要硝普鈉注射量準確、可靠，操作者手法熟練同時環(huán)境溫度恒定，適當延長雙側(cè)頸總動脈夾閉的時間并且增加夾閉次數(shù)沒有嚴重影響大鼠的成活率，并且在術(shù)后通過對Morris水迷宮檢測，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長，在規(guī)定時間內(nèi)穿越平臺的次數(shù)明顯減少，空間記憶障礙明顯，成功建造了大鼠癡呆模型。形態(tài)學觀察可見明顯的CA1區(qū)錐體細胞的變性、死亡、甚至丟失，這一變化印證了行為學的結(jié)果。而且動物沒有明顯的運動系統(tǒng)損傷表現(xiàn)，存活率較高。

［1］ 王蕊，楊秦飛，唐一鵬，等.大鼠擬血管性癡呆模型的改進［J］.中國病理生理雜志，2000，16(10):914-916.

［2］ Vorhees CV，Williams MT.Morris water maze procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory［J］.Nature Protocols，2006，1(2):848.

［3］ 俞德彩，張艷艷，劉巧玲.血管性癡呆與頸動脈粥樣硬化的相關(guān)性研究［J］.中國臨床保健雜志，2005，8(2):118-119.

［4］ 何靜，謝道俊.血管性癡呆的中醫(yī)藥治療［J］.中國臨床保健雜志，2009，12(1):94-96.

［5］ Bomebroke M，Breteler NM.Epidemiology of non-AD dementias［J］.Clin Neurosic Res，2004，3(6):349-361.