黃利，彭瓊，甘惠中，嚴軍寧

(安徽醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院、合肥市第一人民醫(yī)院，a消化內科，b病理科，合肥230061)

胃癌是常見消化道腫瘤之一，其生長分化和侵襲轉移過程中有諸多(抑)癌基因參與。近年來，隨著分子生物學研究的深入，腫瘤預后指標由簡單的病理分期、組織學類型，增加到針對性更強的組織生物學指標檢測。本研究采用免疫組織化學MaxVisionTM2/HRP染色法檢測胃癌組織中 p53蛋白、ki-67抗原和表皮生長因子受體(EGFR)三種癌相關基因蛋白產(chǎn)物，觀察其臨床病理特征及其與預后的關系，以期為胃癌預后判斷及臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集合肥市第一人民醫(yī)院2006年2月至2010年10月手術切除且臨床資料完整的胃癌組織標本66例(男50例，女16例)，所有病人術前均未經(jīng)放化療等抗癌治療。年齡36～82歲，平均(64.2±10.0)歲;其中＜60歲者16例，≥60歲者50例。

病灶部位:胃竇部25例、胃體部13例、胃底賁門部28例。腫瘤長徑≤5 cm 51例、＞5 cm 15例。

病理分型:高分化腺癌17例，中低分化腺癌38例，黏液腺癌及印戒細胞癌11例。腫瘤侵犯深度:肌層內27例、肌層～漿膜外39例。發(fā)生局部淋巴結轉移者42例，無局部淋巴轉移者24例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009年第7版胃癌TNM分期方法進行臨床分期:Ⅰ期19例，Ⅱ期14例，Ⅲ期29例，Ⅳ期4例。

1.2 主要試劑與方法

1.2.1 主要試劑 鼠抗人Ki-67單克隆抗體(工作液)、鼠抗人EGFR單克隆抗體(工作液)、鼠抗人p53單克隆抗體(工作液)、二抗(即用型 MaxVisionTM2/HRP試劑盒)、DAB顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)公司。

1.2.2 免疫組織化學方法 所有組織標本均經(jīng)40 g/L中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別進行HE染色和MaxVisionTM2/HRP法免疫組織化學染色，染色步驟按產(chǎn)品說明書進行。p53、Ki-67采用高壓熱修復2 min，pH值6.0;EGFR采用煮沸抗原修復20 min，pH 值8.5～9.0。以 PBS液代替一抗做陰性對照;以己知的陽性切片作陽性對照。

免疫組織化學染色主要步驟為:4 μm石蠟切片脫蠟和水化后，根據(jù)第一抗體的要求，對組織進行相應的抗原修復;除去PBS，切片上滴加第一抗體，室溫下孵育120 min或4℃過夜，PBS沖洗3×3 min;除去PBS，切片上滴加即用型MaxVisionTM2/HRP試劑，室溫下孵育15 min，PBS沖洗3×3 min;除去PBS，切片上滴加新鮮配制的加強型DAB顯色試劑顯色;自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，(如有必要可用0.1%鹽酸乙醇分化)，PBS返藍，經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.3 陽性結果判斷 在高倍視野下觀察腫瘤細胞，p53蛋白陽性表達為細胞核呈棕褐色顆粒;Ki-67抗原陽性表達為細胞核呈棕褐色顆粒，光鏡下每例隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞數(shù)＜25%為1級，26% ～50%為2級，51%～75%為3級，＞76%為4級，2級以上為陽性;EGFR陽性表達為細胞漿和部分細胞膜染成棕黃色，胞槳內呈棕黃色顆粒。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 17.0軟件，陽性表達率的比較用采用卡方檢驗(χ2檢驗)或Fisher確切概率法。

2 結果

2.1 p53蛋白、ki-67抗原、EGFR在胃癌組織中的表達 p53蛋白、ki-67抗原主要表達在細胞核，EGFR主要表達于胞核和胞漿(見圖3)。各分子標記物在胃癌組織中的陽性表達率為:p53蛋白53.03%(35/66)，ki-67 抗 原 62.12%(41/66)，EGFR 42.42%(28/66)。66例胃癌的臨床病理特征與各分子標記物表達之間的關系見表1。

表1 p53、ki-67、EGFR各分子標記物表達與胃癌臨床特征之間的關系(例)

2.2 p53、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測與與胃癌臨床病理參數(shù)之間的關系 p53、ki-67、EGFR三者聯(lián)合檢測陽性率(見表2)，在胃癌浸潤深度T1時為0/9，而與其他浸潤深度(9/9)對比明顯不同;在無淋巴結轉移者為2/9，有淋巴結轉移者為7/9，也有一定差別。p53、ki-67兩者聯(lián)合檢測及p53、ki-67、EGFR三者聯(lián)合檢測均在不同胃癌TNM分期之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表2 p53、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測陽性表達與胃癌臨床病理特征之間的關系(例)

3 討論

p53作為對細胞分裂與增殖起負調控作用［1］的抑癌基因，是人類腫瘤相關性最高的基因。突變型p53蛋白較野生型p53蛋白半衰期長且穩(wěn)定，故目前免疫組織化學檢測的p53蛋白均為突變型。研究發(fā)現(xiàn)超過60%的胃癌中出現(xiàn)p53基因突變［2］，p53蛋白在胃癌中表達率 25.2% ～65.12%［3-4］，有研究顯示p53蛋白高表達與胃癌位于賁門部［5］、腫瘤直徑 ＞5 cm、TNM 分期差［6-7］、分化程度低［8］等有關，與胃癌的總生存率及腸型胃癌的生存率有關［5］;也有報道，p53的表達與胃癌腫瘤直徑、分化程度、浸潤深度和有無淋巴轉移無關，與遠處轉移有顯著性相關［9］。本研究結果提示胃癌中p53蛋白陽性表達率53.03%(35/66)，胃癌長徑＞5 cm者、有淋巴結轉移者p53蛋白表達率明顯高于≤5cm者、無淋巴結轉移者，說明p53過表達參與胃癌的發(fā)生、浸潤和轉移，可作為胃癌患者預后評估的一項參考指標。

ki-67為敏感的細胞核增殖標記物，用于判斷腫瘤的增殖活性。多個研究顯示ki-67抗原高表達與胃癌的淋巴結轉移有關［10-13］，與胃癌的侵襲、低分化、淋巴結轉移顯著相關［11］，而與患者年齡、性別，胃癌TNM分期無關［14］。但也有研究顯示Ki-67表達與胃癌的生長方式、浸潤深度、淋巴結轉移與否及TNM分期無關，僅與分化有關［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，高分化胃腺癌ki-67陽性表達率低于中低分化胃腺癌、印戒細胞癌及黏液腺癌，提示ki-67陽性表達率越高，胃癌分化類型越差，因而其預后越差。

EGFR是原癌基因c-erbB-1的表達產(chǎn)物，具有促進腫瘤細胞增殖、黏附、血管生成等作用，在多種惡性腫瘤中高表達。有研究認為EGFR高表達是胃癌預后的獨立危險因素，也有文獻報道EGFR在胃癌中表達很低。本研究結果顯示胃癌浸潤至漿膜者、有淋巴結轉移者EGFR陽性表達率明顯高于浸潤肌層以內者、無淋巴結轉移者，提示EGFR高表達與胃癌浸潤和轉移有關。

鑒于單獨檢測p53蛋白、ki-67、EGFR表達文獻報道的不確定性，本研究進一步分析實驗結果發(fā)現(xiàn):p53、ki-67、EGFR三者同時陽性表達為9例，其中腫瘤浸潤深度T1時為0/9，在無淋巴結轉移者為2/9，有淋巴結轉移者為7/9，提示與胃癌的侵襲性密切相關;TNM分期Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ者與Ⅰ者p53蛋白、ki-67、EGFR三者同時陽性表達差異有統(tǒng)計學意義，依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟推出的第7版的TNM分期，T或N分期各亞組患者之間的5年累積生存率(5YSR)差異有統(tǒng)計學意義，如ⅠA患者的5YSR為95.1%，ⅡA期為84.0%，ⅡB期為71.7%，ⅢA 期為58.4%，ⅢB期為41.3%，ⅢC期為26.1%等，據(jù)此我們認為p53蛋白、ki-67、EGFR聯(lián)合檢測與胃癌TNM分期相關，對胃癌預后的評估有重要意義。

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