陳珂 王博 張秀珍

（1.上海曲陽醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200092；2.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，上海 200090；3.同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院，上海 200065）

據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，2015年我國糖尿病患病率將超過10%，患者總?cè)藬?shù)將超過1億［1］。隨著糖尿病發(fā)病率和患病率的升高，各種糖尿病慢性并發(fā)癥的患病率也逐步攀升。骨代謝異常所致骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是糖尿病最常見的慢性并發(fā)癥之一。OP與2型糖尿?。╰ype 2diabetes mellitus，T2DM）均是由多種基因共同決定并受環(huán)境等因素影響的多發(fā)病。婦女在絕經(jīng)后最初5年中，骨量丟失顯著加速［2］。轉(zhuǎn)化生長因子－β是調(diào)節(jié)細胞生長、分化的重要細胞因子，可促進成骨細胞復(fù)原和增殖，也可通過調(diào)節(jié)成骨細胞對骨的沉積作用和破骨細胞對骨的吸收作用而控制骨密度（bone mineral density，BMD）［3］。本研究通過研究轉(zhuǎn)化生長因子－β1－509（transforming growth factor－Β1－509，TGF－β1－509）基因多態(tài)性各等位基因及基因型在絕經(jīng)后5～10年內(nèi)T2DM女性中的分布頻率，旨在從基因水平探討T2DM并發(fā)OP的遺傳因素。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2007年2月—2011年12月同濟大學(xué)附屬同濟醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的上海地區(qū)漢族絕經(jīng)女性患者共282例，其中OP患者105例（OP組），T2DM患者骨量正常患者90例（T2DM組），T2DM并發(fā)OP患者87例（T2DM 并發(fā)OP組）；另選取健康絕經(jīng)女性82例作為對照 （對照組）。所有研究對象半年內(nèi)未服用性激素、甲狀旁腺激素、雙磷酸鹽、降鈣素、糖皮質(zhì)激素等影響骨代謝的藥物。糖尿病診斷符合1999年美國糖尿病協(xié)會（American Diabetes Association，ADA）診斷標準，即空腹血糖＞7.0mmol／L，餐后2h血糖＞11.1mmol／L；OP的診斷標準［4］：BMD低于同性別峰值BMD平均值2.5個標準差值（T ≤－2.5）。

1.2 研究方法 所有研究對象均測量身高、體質(zhì)量、計算體質(zhì)指數(shù)（body mass index，BMI）。均于早晨抽空腹肘靜脈血5mL，－80℃保存。采用高壓液相法測定糖化血紅蛋白 A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）。基因組DNA的提取采用基因組DNA快速提取試劑盒。

1.3 BMD測定 采用美國Lunar公司生產(chǎn)的DEXA BMD測量儀，測定第2～4腰椎（L2－4）的BMD（g／m2）。每次測量前均行體模測試，BMD測量的變異系數(shù)（CV）為0.24%～0.69%。

1.4 TGF－β1－509 基 因 分 型 上 游 引 物 5＇－CTC CAT TTC CAG GTG TGG TCC CA－3＇，下游引物5＇－CAC CAA AGC GGG TGA TCC AGA T－3＇。以100ng DNA為模板在25μL反應(yīng)容積中進行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。以限制性內(nèi)切酶Eco 81Ⅰ（北京紐英倫生物技術(shù)有限公司）在37℃酶解PCR產(chǎn)物2h，最后經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳分離酶解產(chǎn)物片段。如果－509位點為C則會被內(nèi)切酶Eco 81Ⅰ切成237bp和628bp2個片段；如果－509位點為T則不會被內(nèi)切酶Eco 81Ⅰ切開，只顯示1條865bp的片段。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標準差（ˉx±s）表示。組間比較用單因素方差分析（ANOVA）與最小顯著差法（least significant difference，LSD）兩兩比較以及兩因素方差分析（two way ANOA）。計數(shù)資料以頻數(shù)與百分率表示，組間比較采用卡方檢驗（χ2檢驗）。雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 OP組、T2DM組、T2DM并發(fā)OP組與對照組的年齡、絕經(jīng)年限、BMI、HbA1c、L2－4 BMD以及TGF－β1－509基因型和等位基因分布頻率比較見表1。

2.2 TGF－β1－509基因型和等位基因分布頻率的比較 OP組、T2DM組、T2DM并發(fā)OP組和對照組TGF－β1－509等位基因型 C、T 的分布無顯著差異（χ2＝1.992、0.400、1.766；P＝0.158、0.527、0.184）。合并OP組（OP組＋T2DM并發(fā)OP組）和非OP組（T2DM組＋對照組）等位基因型C、T的分布頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2＝5.966，P＝0.015），見表2。

2.3 TGF－β1－509基因型與L2－4BMD的關(guān)系 OP組、T2DM組、T2DM并發(fā)OP組和對照組CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，各組L2－4BMD都呈CC＞CT＞TT趨勢，但無顯著差異，各基因型組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。合并OP組和非OP組CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，各組的L2－4BMD都呈CC＞CT＞TT趨勢，但無顯著差異，各基因型組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。

表1 OP組、T2DM組、T2DM并發(fā)OP組與對照組相關(guān)指標比較（ˉx±s）

表2 OP組與非 OP組TGF－β1－509等位基因分布頻率比較n（%）

表3 OP組、T2DM組、T2DM＋OP組和對照組TGF－β1－509基因多態(tài)性與L 2～4BMD的關(guān)系（ˉx±s，g／cm2）

表4 OP組和非 OP組TGF－β1－509各基因型L 2～4BMD測定結(jié)果（ˉx±s，g／cm2）

2.4 TGF－β1－509基因多態(tài)性與糖代謝的關(guān)系T2DM組和T2DM并發(fā)OP組TGF－β1－509基因位點CC基因型、CT基因型、TT基因型比較，HbA1c差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。各基因型組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表5。

表5 T2DM 組和T2DM＋OP組TGF－β1－509各基因型HbA1c測定結(jié)果（ˉx±s，g／cm2）

3 討 論

TGF－β可刺激成骨細胞增殖、分化，促進細胞外基質(zhì)合成，可促進骨與軟骨形成，加速破骨細胞凋亡。體外實驗研究［5］結(jié)果表明，TGF－β有強大骨形成和骨修復(fù)作用，可使骨密度增加。TGF－β對破骨細胞的作用表現(xiàn)為減少破骨細胞的數(shù)量和抑制單個破骨細胞的骨吸收活性。破骨細胞通過對骨基質(zhì)進行酸性水解溶解骨質(zhì)，同時破骨細胞造成的酸性環(huán)境也可激活 TGF－β。文獻［6］報道 TGF－β1基因啟動子－509位點T等位基因可能提高TGF－β1的轉(zhuǎn)錄水平，從而增加TGF－β1基因的表達。本研究中合并OP組各基因型組L2－4BMD值都呈現(xiàn)CC＞CT＞TT的趨勢，提示隨著T等位基因的增多，TGF－β1表達增多，從而影響B(tài)MD。但合并OP組與非OP患者比較BMD差異無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能為：（1）不同基因之間存在復(fù)雜的交互作用，BMD受多個基因調(diào)控，多個易感基因組合構(gòu)成了該病的遺傳易感性，單一基因作用可能有限；（2）環(huán)境因素，遺傳和環(huán)境之間存在復(fù)雜的交互作用，生活習(xí)慣、體育鍛煉、飲食營養(yǎng)狀況以及鈣、維生素D攝取水平等對研究結(jié)果有很大影響；（3）本研究樣本量小，混雜因素多。因此，有待對不同種族、不同人群進一步設(shè)計更嚴密的大樣本研究。

本研究對 TGF－β1－509基因多態(tài)性與 HbA1c水平相關(guān)性的研究，在國內(nèi)外尚屬首次。T2DM組、T2DM 并發(fā)OP組的HbA1c水平在TGF－β1－509基因多態(tài)性的3組基因型之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，TGF－β1－509基因多態(tài)性可能無法預(yù)測T2DM患者及T2DM并發(fā)OP患者骨代謝和糖代謝的水平，其原因可能為HbA1c更多反映的是糖尿病的治療效果，而且受到藥物、飲食等的影響。

本研究結(jié)果表明，TGF－β1－509等位基因型 T可能是OP的易感基因，T2DM患者TGF－β1－509基因型與HbA1c無相關(guān)性，由于樣本量較小，尚需進一步研究。

［1］ 徐炯，劉軍，查英，等.上海市閔行區(qū)江川社區(qū)老年糖尿病患病率調(diào)查［J］.中國臨床醫(yī)學(xué)，2011，18（2）：198－200.

［2］ Anaforoglu I，Nar－Demirer A，Bascil－Tutuncu N，et a1.Prevalence of osteoporosis and factors affecting bone mineral density among postmenopausal Turkish women with type 2diabetes［J］.Diabetes Complications，2009，23（1）：12－17.

［3］ Jian H，Shen X，Liu I，et al.Smad3－dependent nuclear translocation of beta－catenin is required for TGF－beta1－induced proliferation of bone marrow－derived adult human mesenchymal stem cells［J］.Genes Dev，2006，20（6）：666－674.

［4］ 中華醫(yī)學(xué)會骨質(zhì)疏松和骨礦鹽分會.原發(fā)性骨質(zhì)疏松診治指南［J］.中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志，2011，4（1）：2－17.

［5］ Janssens K，ten Dijke P，Janssens S，et al.Transforming growth factor－beta1to the bone［J］.Endocr Rev，2005，26（6）：743－744.

［6］ Silverman ES，Palmer LJ，Subramaniam V，et al.Transforming growth factor－β1promoter polymorphism C－509Tis associated with asthma［J］.Am J Respir Crit Care Med，2004，169（2）：214－219.