摘 要 建立了基于核酸雜交及連接酶和核酸內(nèi)切酶的酶聯(lián)橋接分析（ELBA）系統(tǒng)，用于生物基質(zhì)中反義寡核苷酸（ODN）藥物的定量分析。對ELBA系統(tǒng)中的親和素包被、俘獲探針/檢測探針濃度、T4 DNA 連接酶及S1核酸酶用量、堿性磷酸酶底物反應(yīng)時間等條件進行了優(yōu)化，確定使用中性親和素包被的酶標板， 俘獲探針與檢測探針濃度比為2∶3，S1酶為40 U/孔，顯色15 min為最優(yōu)條件，并考察了生物基質(zhì)效應(yīng)和稀釋效應(yīng)對方法的影響，建立了獼猴血漿中反義寡核苷酸的定量方法，并進行方法學(xué)確證，方法學(xué)定量范圍為0.10～6.25 nmol/L。本方法成功應(yīng)用于反義硫代寡核苷酸藥物在低劑量（1 mg/kg）靜脈滴注后的藥代動力學(xué)研究，成為生物基質(zhì)中寡核苷酸類藥物定量分析的有效手段。

關(guān)鍵詞 寡核苷酸； 藥代動力學(xué)； 定量； 核酸雜交； 酶聯(lián)橋接分析系統(tǒng)

1 引 言

反義（Antisense，AS）寡核苷酸（Oligodeoxynucleotide，ODN）、免疫刺激基序（CpG）ODN等分子，在抗腫瘤、抗病毒治療等基因治療領(lǐng)域中占據(jù)重要地位。迄今，ASODN與CpG ODN類藥物經(jīng)美國FDA批準上市，已有多種該類藥物處于臨床前和臨床試驗階段\\。

目前，生物樣品中ODN藥物的定量分析方法最為成熟，其中應(yīng)用最多的是非放射性同位素標記定量分析方法， 包括毛細管電泳（Capillary electrophoresis， CE）和高效液相色譜法（High performance liquid chromatography， HPLC）。CE方法對于ODN的檢測具有高分辨率、可分辨相差一個核苷酸的ODN，其在血漿基質(zhì)中對ODN的最低定量限（Lower limit of quantification， LLOQ）約在70 g/L（約12 nmol/L）\\水平。本課題組曾利用改良的毛細管非膠篩分電泳方法對硫代修飾ASODN進行藥代動力學(xué)研究\\，可描述5 mg/kg以上劑量給藥后獼猴的血漿動力學(xué)行為，但該方法對于末端消除相數(shù)據(jù)的獲得不甚理想，對于更低劑量下（如1 mg/kg）給藥后的藥時曲線描述更是無能為力。HPLC方法的分辨率和靈敏度與CE方法相比略低。目前ODN類藥物通常在較低劑量下（≤1 mg/kg \\）給藥即能發(fā)揮藥效，這對定量分析方法學(xué)的靈敏度提出越來越高的要求。上述方法的靈敏度難以達到對ODN在血漿和組織中藥代動力學(xué)（Pharmacokinetics，PK）終末消除相的定量能力（濃度通常低于10 nmol/L） \\。此外，上述兩種主流分析方法還有一個共同的缺陷，即樣品前處理過程相當復(fù)雜，絕對回收率低，分析周期長、成本高，應(yīng)用受限\\。

核酸分子雜交的酶聯(lián)橋接（Enzymelinked bridging assay，ELBA）法基于核酸雜交原理，利用一個錨定的、3′端與待測反義寡核苷酸（Test ODN）序列互補的俘獲探針俘獲生物基質(zhì)中的Test ODN，再通過連接酶將檢測探針（序列與俘獲探針5′端互補，3′端偶聯(lián)酶標顯色系統(tǒng)）與上述核酸雜交復(fù)合物相連，建立橋接體系。S1核酸內(nèi)切酶是單鏈特異性的核酸內(nèi)切酶，可以降解雙鏈核酸中的單鏈或缺口處切割雙鏈 DNA，在上述橋接體系中，可以通過酶切將不能與檢測探針連接從而構(gòu)成完整雙鏈的差減ODN序列（即ODN的降解產(chǎn)物，其3′端與檢測探針5′端之間有1個以上的堿基缺口）去除，以保證橋接系統(tǒng)的序列長度特異性。最終利用檢測探針3′端偶聯(lián)的酶標顯色系統(tǒng)，對Test ODN原形進行定量。酶聯(lián)橋接分析系統(tǒng)的的原理如圖1所示。該方法在靈敏度、特異性以及適用性上均較傳統(tǒng)的定量分析方法具有優(yōu)勢\\，因此，基于核酸雜交的ELBA系統(tǒng)在寡核酸類藥物PK研究中具有巨大的應(yīng)用前景。本研究對所建立ELBA系統(tǒng)中的諸多條件，包括親和素包被、俘獲探針與檢測探針濃度比、T4連接酶及S1核酸酶用量、生物基質(zhì)效應(yīng)、稀釋效應(yīng)以及顯色系統(tǒng)等進行了細致的優(yōu)化，使系統(tǒng)更具穩(wěn)定性與通用性。 

圖1 酶聯(lián)橋接分析系統(tǒng)的原理

Fig．1 Principle of enzymelinked bridging assay （ELBA）

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

HeraeusBB5060培養(yǎng)箱（上海賀利氏公司）；超純水系統(tǒng)（美國MILLIPORE公司）；微量振蕩器（國華電器有限公司）；微量加樣器（美國Gilson公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京長風(fēng)公司）；MK 3酶標儀（德國Thermo公司）。

鏈霉親和素（Streptavidin，SA， Promega公司）；鏈霉親和素包被酶標板（StreptavidinCoated 96well plate， Cayman Chemical公司）；T4 DNA 連接酶（NEB公司）；S1核酸酶（Invitrogen公司）；酶標抗地高辛抗體（Antidigoxigeninalkaline Phosphatase，ADAP， Roche公司）；中性親和素包被的酶標板（ReactiBind NeutrAvidin Coated），封閉液（SuperBlock Blocking buffer）和顯色液（pNitrophenyl phosphate，PNPP）均購自Pierce公司。

本研究中采用ODN及其核酸探針由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列結(jié)構(gòu)見表1。其它生化試劑：TrisHCl， HCl， Na2HPO4，NaCl， NaHCO3， Tween20， EDTA和曲拉通等均為分析純試劑。

L，加入反應(yīng)孔中，18 ℃過夜連接。洗滌后加入一定酶活單位的S1核酸內(nèi)切酶，37 ℃酶切1.5 h后洗板。

2.2.3 顯色反應(yīng) 封閉液在37 ℃反應(yīng)30 min后，加入酶標抗體（1∶1500稀釋于2%牛血清白蛋白中），室溫振蕩反應(yīng)30 min。洗滌后加入新鮮配制PNPP顯色液，37 ℃反應(yīng)15～30 min。加入2 mol/L NaOH終止，用酶標儀檢測405/630 nm處光吸收值（Optical density，OD）值。

2.3 實驗條件的優(yōu)化

2.3.1 親和素包被的條件選擇 100 nmol/L Test ODN經(jīng)二次蒸餾水（ddH2O）倍比稀釋至0.39 nmol/L，隨行零對照，各濃度復(fù)孔，重復(fù)3次?？疾炝?種親和素包被條件對靈敏度和響應(yīng)值的影響：（1）Pierce公司中性親和素包被酶標板；（2） CAYMAN CHEMICAL公司鏈霉親和素包被酶標板；（3） 鏈霉親和素25 mg/L和50 mg/L包被的96孔板（包被緩沖液：15 mmol/L Na2CO3，35 mmol/L NaHCO3，pH 9.6）。

2.3.2 優(yōu)化探針濃度 從兩個角度優(yōu)化俘獲探針和檢測探針濃度: （1）Test ODN濃度為5 nmol/L時，考察俘獲探針在100 nmol/L條件下，不同濃度（50，75，100，150和200 nmol/L）檢測探針對應(yīng)OD值變化曲線，反之考察俘獲探針的最優(yōu)濃度。（2）倍比稀釋12.5 nmol/L Test ODN至0.78 nmol/L，檢測探針與俘獲探針比例分別為150∶100，150∶150 和 150∶200對方法線性的影響。

2.3.3 優(yōu)化PNPP顯色時間 獼猴血漿倍比稀釋12.50 nmol/L Test ODN至0.39 nmol/L，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件，考察PNPP顯色步驟中不同顯色時間（15， 20和30 min）對定量曲線線性的影響。

2.3.4 S1酶用量的優(yōu)化 獼猴血漿倍比稀釋 Test ODN 12.50 nmol/L至0.39 nmol/L，加零對照，考察S1酶不同加入量（5，10，20，40，80和100 U/孔）對線性的影響。

2.4 生物基質(zhì)的影響 

分別以獼猴全血漿和ddH2O為基質(zhì)倍比稀釋12.5 nmol/L Test ODN至0.39 nmol/

L，并將另行配制的兩份同濃度的血漿樣品稀釋1倍和10倍，對比考察生物基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。

2.5 利用ELBA和CE方法對獼猴體內(nèi)低劑量給藥PK研究

4只獼猴單次靜脈滴注（v.d.）1 mg/kg Test ODN，30 min內(nèi)恒速靜脈滴注完畢，分別于給藥前（0 min）以及滴注開始后0.2，0.3，0.5，0.35，0.75，1.0，1.25，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，6.0 和8.0 h，在給藥部位對側(cè)后肢靜脈取血，血樣均用EDTAK2抗凝管采集，3000 g 離心收集血漿樣品于80 ℃保存待測。ELBA對樣品測定時同板隨行標線和質(zhì)控樣品，根據(jù)標線對生物樣品中 Test ODN進行定量分析。

CE定量的樣品前處理和測定方法參見文獻\\。單次靜脈滴注5 mg/kg Test ODN，給藥方式和血樣采集同ELBA方法。

血漿樣品中對Test ODN 原形、3′N1和5′N1降解產(chǎn)物進行12.5 nmol/L至0.39 nmol/L的倍比稀釋，通過計算交叉反應(yīng)性確定該方法針對原形藥物測定的特異性，計算公式為：降解產(chǎn)物的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）/Test ODN 原形的半數(shù)效應(yīng)濃度（EC50）。

2.6 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL2007對所得數(shù)據(jù)進行整理并用ORIGIN 5.0對整理后數(shù)據(jù)進行擬合作圖，藥代動力學(xué)參數(shù)使用WinNonlin進行計算。3 結(jié)果與討論

3.1 實驗條件優(yōu)化

3.1.1 不同包被條件對定量范圍的影響

鏈霉親和素包被酶標板（CAYMAN CHEMICAL公司）與自制兩種鏈霉親和素包被量的酶標板反應(yīng)性能相同，在10 ～100 nmol/L較高濃度范圍可呈良好線性，提示增加鏈霉親和素包被量并不能提高靈敏度。與鏈霉親和素包被相比，中性親和素包被酶標板（Pierce公司）本底較低，靈敏度高；在0.5 ～7.5 nmol/L可呈線性遞增趨勢（圖2A）。中性親和素和鏈霉親和素分子量相同，均可與生物素結(jié)合，但是前者與生物素結(jié)合時非特異性結(jié)合最低，可以大大提高特異性和靈敏度。本研究以建立高靈敏度的定量分析方法為目標，選擇Pierce公司中性親和素包被的酶標板進行后續(xù)實驗。

3.1.2 優(yōu)化探針濃度 固定 Test ODN濃度為5 nmol/L，檢測探針濃度為100 nmol/L的條件下，俘獲探針在100 nmol/L 以下信號值與濃度呈明顯正相關(guān)，大于100 nmol/L呈飽和趨勢，同樣在固定 Test ODN為5 nmol/L，俘獲探針在100 nmol/L的條件下，檢測探針濃度在100 nmol/L以下信號值與濃度呈明顯正相關(guān)，到達100 nmol/L后呈飽和趨勢（圖2B）。俘獲探針與檢測探針的不同濃度比例對該方法定量范圍的影響結(jié)果表明，當兩者比例為2∶3時， Test ODN濃度在0.78 ～12.5 nmol/L范圍內(nèi)與響應(yīng)值呈正相關(guān)關(guān)系，且響應(yīng)值較高（圖2C）。 

圖2 實驗條件的優(yōu)化

Fig．2 Optimization of experiment conditions

A． 不同包被條件對響應(yīng)值的影響 （Effect of different coating conditions on response）; B． 俘獲探針和檢測探針濃度的優(yōu)化 （Optimization of concentrations of capture probe and detection probe）; C． 俘獲探針和檢測探針最佳比例 （Optimization of concentration ratio of capture probe and detection probe; D. PNPP顯色時間的優(yōu)化（Optimization of pnitrophenyl phosphate （PNPP） coloration time）。

3.1.3 優(yōu)化PNPP顯色時間 PNPP顯色時間延長可以增強各濃度標準品下的信號強度，但是對標準曲線的線性影響較大，因此檢測中將顯色時間定為15 min（圖2D）。

3.1.4 優(yōu)化S1酶用量 S1 核酸酶的用量是影響所建方法的線性范圍和特異性（原形和降解產(chǎn)物的區(qū)分）的關(guān)鍵因素。S1酶用量過少不能完全去除單鏈檢測探針以及降解產(chǎn)物引起的背景信號，過多則會對結(jié)合的雙鏈雜交分子非特異降解，原形ODN的信號值下降明顯，且線性較差。根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，本研究在Test ODN在40 U/孔的酶量下，可以獲得最優(yōu)線性范圍（圖3），并具有良好的特異性，能區(qū)分原形和降解產(chǎn)物。S1酶對3′N1降解產(chǎn)物的作用更為特異，交叉反應(yīng)性＜10%，對5′N1降解產(chǎn)物的交叉反應(yīng)性＜25%（圖4），而生物體內(nèi)ODN的大部分降解產(chǎn)物均由3′外切核酸酶產(chǎn)生ODN，即以3′端降解產(chǎn)物為主。

圖3 S1酶用量的優(yōu)化

Fig．3 Optimization of S1 nuclease amount

圖4 Test ODN原形與其3′N1 和5′N1降解產(chǎn)物的區(qū)分

Fig．4 Distinction between parent ODN and its 3′N1 and 5′N1degradation products

3.2 生物基質(zhì)對定量分析的影響?yīng)?/p>

生物樣品中定量分析的難點在于生物基質(zhì)的干擾效應(yīng)，常規(guī)解決辦法是對樣品進行適當稀釋以降低信噪比，提高響應(yīng)值。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度生物樣品進行稀釋處理會導(dǎo)致靈敏度下降無法檢測，與以ddH2O為基質(zhì)相比，100%獼猴血漿中同濃度 Test ODN的響應(yīng)值并未受到影響（圖5），證明ELBA方法不受血漿基質(zhì)干擾，反義寡核苷酸血漿樣品不需任何樣品前處理可直接應(yīng)用ELBA方法進行定量分析。

3.3 方法學(xué)確證

3.3.1 定量范圍、精密度、準確度 獼猴血漿中配制標準品（12.5， 6.25，3.13，1.56，0.78，0.39，0.20和0.10 nmol/L）制備標準曲線，批間重復(fù)5次。隨行配制高（5 nmol/L）、中（0.50 nmol/L）、低（0.15 nmol/L）質(zhì)控樣品考察精密度和準確度。ELBA方法對Test ODN在獼猴血漿中的定量范圍為0.10～6.25 nmol/L（R2＞0.99）（圖6），較CE方法的靈敏度提高了近1000倍。 5批樣品的批內(nèi)和批間質(zhì)控樣品測定結(jié)

圖5 生物基質(zhì)對ODN定量分析的影響?yīng)?/p>

Fig．5 Effect of biological matrix on quantitative analysis of ODN

圖6 血漿中Test ODN定量標準曲線

Fig．6 Standard curve of quantification of Test ODN in plasma by ELBA

果表明ELBA對Test ODN的定量方法批內(nèi)相對誤差為10.6%～15.4%，精密度＜18.23%，批間相對誤差為4.67%～8.23%（n＝5），精密度為＜7.91%。

3.3.2 稀釋效應(yīng) 考察樣品稀釋對樣品濃度檢測準確度的影響。根據(jù)實驗需要分別用獼猴血漿配制濃度為1000，500，100，50和10 nmol/L的樣品溶液并稀釋至1 nmol/L，考察稀釋倍數(shù)為1000， 500， 100， 50和10的稀釋效應(yīng)。實驗結(jié)果見表2，驗證樣品的相對誤差（RE）＜15%；結(jié)果表明，對血漿樣品進行10～1000倍稀釋后測定，結(jié)果仍準確可信。