摘 要 建立了同時(shí)檢測(cè)食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯的高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器（HPLCDAD）定量分析方法。樣品用乙腈提取，經(jīng)LCC18固相萃取柱凈化，采用Agilent C18色譜柱分離，甲醇/水溶液梯度洗脫，二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：6種對(duì)羥基苯甲酸酯在1.0～500.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.9997）；檢出限為0.0016～0.0081 mg/L（S/N＝3）；6種對(duì)羥基苯甲酸酯各添加水平在經(jīng)表面處理的新鮮蔬菜、水果、醋、碳酸飲料及牛奶，食品餡料中的回收率為85.1%～95.4%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～10.9%。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法； 對(duì)羥基苯甲酸酯； 固相萃??； 食品

1 引 言

對(duì)羥基苯甲酸酯為常用防腐劑之一，其抑菌范圍廣、作用強(qiáng)、用量少、毒性低、易配伍且防腐效果不易隨pH值的變化而變化，在堿性環(huán)境下尚有效\\，對(duì)食品起到保鮮與防腐作用。近年來(lái)，對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑被廣泛應(yīng)用于各種食品中，但是大量或不當(dāng)使用防腐劑會(huì)對(duì)人體造成一定損害，如有雌激素樣作用，影響人的內(nèi)分泌功能等\\。因此，中國(guó)、加拿大、日本和歐盟等許多國(guó)家和國(guó)際組織對(duì)食品中對(duì)羥基苯甲酸酯類防腐劑的使用制定了添加限量\\。

目前，對(duì)羥基苯甲酸酯的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法\\、薄層色譜法\\、氣相色譜法\\ 、氣相色譜質(zhì)譜法\\和毛細(xì)管電泳法\\等。王萍亞等\\用高效液相色譜法測(cè)定腌菜中6種對(duì)羥基苯甲酸酯； 迪麗努爾·馬力克等\\用氣相色譜法測(cè)定液狀食品中4種對(duì)羥基苯甲酸酯等。這些文獻(xiàn)方法多是對(duì)一類樣品基質(zhì)中的幾種對(duì)羥基苯甲酸酯的含量進(jìn)行測(cè)定，適用范圍較窄。本研究建立了同時(shí)測(cè)定蔬菜、水果（經(jīng)表面處理）、碳酸飲料、牛奶、醋、食品餡料等食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯的高效液相色譜二極管陣列檢測(cè)器的分析方法。與已報(bào)道的文獻(xiàn)方法相比，本方法的檢出限更低，線性范圍更寬，適用于同時(shí)測(cè)定各種食品基質(zhì)中6種對(duì)羥基苯甲酸酯的含量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

1200高效液相色譜儀（DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司）；4011 Digital旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；XHB型振蕩器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）；330K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；LCC18固相萃取小柱（美國(guó)SUPELCO公司）。對(duì)羥基苯甲酸（甲、乙、異丙、丙、異丁、?。?biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%，奪Dr. Ehrenstorfer GmbH）；乙腈、甲醇（色譜純，美國(guó)TEDIA公司）；其它試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

2.2 樣品的提取

稱取5.0 g樣品于50 mL 離心管中，加入2 mL 2 mol/L乙酸銨緩沖液（pH＝6.5）振蕩溶解，加入2 g NaCl，15 mL 乙腈振蕩提取，再加入10 mL 乙腈振蕩提取兩次，合并提取液于旋蒸瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，待凈化。

2.3 樣品的凈化

用2 mL 35%甲醇溶解上述步驟處理的殘?jiān)?，并轉(zhuǎn)入已用5 mL甲醇，5 mL水活化的LCC18固相萃取小柱，用3 mL 30%甲醇淋洗，5 mL 5%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，置于40 ℃氮吹儀上濃縮至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解振蕩2 min，過(guò)0.45

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件選擇

在參照文獻(xiàn)\\的基礎(chǔ)上選擇甲醇和水為流動(dòng)相，等度洗脫始終不能將對(duì)羥基苯甲酸丙酯和異丙酯、丁酯和異丁酯有效分離；因此，對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，在2.4節(jié)的色譜條件下，6種對(duì)羥基苯甲酸酯得到有效分離，且靈敏度較高。6種對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 6種對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

Fig．1 Chromatogram of 6 kinds of 4hydrobenzoic acid ester standardsolution

標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為 5.0 mg/L，1. 對(duì)羥基苯甲酸甲酯; 2. 對(duì)羥基苯甲酸乙酯; 3. 對(duì)羥基苯甲酸異丙酯; 4. 對(duì)羥基苯甲酸丙酯; 5. 對(duì)羥基苯甲酸異丁酯; 6. 對(duì)羥基苯甲酸丁酯。

Concentration of standardsolution was 5.0 mg/L， 1. 4hydrobenzoic acid methyl ester; 2. 4hydrobenzoic acid ethyl ester; 3. 4hydrobenzoic acid isopropyl ester; 4. 4hydrobenzoic acid propyl ester; 5. 4hydrobenzoic acid isobutyl ester; 6. 4hydrobenzoic acid butyl ester.

3.2 提取溶劑的選擇

對(duì)羥基苯甲酸酯難溶或微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈等有機(jī)溶劑\\。本研究對(duì)上述幾種溶劑的提取效率進(jìn)行了考察。結(jié)果表明，甲醇、乙醇、丙酮、甲醇乙腈（1∶1， V/V）對(duì)部分基質(zhì)的提取效率不高，且提取溶液渾濁，旋蒸過(guò)程中易鼓泡，不易操作；乙醚、乙腈對(duì)食品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯的提取效率高，提取溶液清澈，易進(jìn)行固相萃取凈化。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.312003 \\采用乙醚提取，乙醚沸點(diǎn)低，揮發(fā)性強(qiáng)，易燃易爆，且產(chǎn)生大量有機(jī)廢液，為了能同時(shí)預(yù)處理多種類的樣品基質(zhì)，并可同時(shí)檢測(cè)6種對(duì)羥基苯甲酸酯，本研究選擇了干擾較少，回收率和選擇性都滿足要求的乙腈作為提取溶劑。

3.3 凈化方法的選擇

3.3.1 固相萃取小柱（SPE）的選擇 食品種類繁多，含有大量不確定干擾物，進(jìn)樣前需對(duì)樣品進(jìn)行有效凈化。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.312003 \\采用液液萃取對(duì)食品中2種對(duì)羥基苯甲酸酯進(jìn)行凈化，操作繁瑣，產(chǎn)生大量有機(jī)廢液。固相萃取凈化技術(shù)能有效分離目標(biāo)化合物與基體干擾物，且分析時(shí)間短，溶劑使用量少，操作簡(jiǎn)便。本研究對(duì)HLB\\ 和LCC18\\固相萃取小柱（SPE）進(jìn)行了優(yōu)化選擇。結(jié)果表明，LCC18柱對(duì)樣品中6種對(duì)羥基苯甲酸酯有較好保留，回收率高。因此，選擇LCC18柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化。

3.3.2 淋洗液的選擇

樣品上柱后，有些干擾物質(zhì)會(huì)與被測(cè)物一起被吸附，有必要在洗脫被測(cè)物前，先淋洗萃取柱去除雜質(zhì)。在空白樣品基質(zhì)中添加1.0 mg/kg對(duì)羥基苯甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)乙腈提取濃縮后上LCC18固相萃取柱，以不同濃度的甲醇作為淋洗液，考察其回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，采用30%甲醇淋洗液，既能有效去除干擾雜質(zhì)，又不會(huì)將目標(biāo)化合物洗脫，不同淋洗液的液相色譜圖見(jiàn)圖2。因此，選擇30%甲醇作為淋洗液。

3.3.3 洗脫液的選擇 對(duì)不同濃度的氨化甲醇洗脫效果進(jìn)行了考察，洗脫能力隨氨水濃度增大而增強(qiáng)，干擾成分也會(huì)增加。從表2可見(jiàn)：用5%氨化甲醇洗脫時(shí)，6種對(duì)羥基苯甲酸酯均被洗下，回收率均較高，且干擾成分少。因此，選擇5%的氨化甲醇為洗脫液。