摘 要 建立了動物性食品肉、蛋和奶中雙酚A、壬基酚和辛基酚的超高效液相色譜串聯(lián)質譜（UPLCMS/MS）檢測方法。比較了固相萃取法（SPE）和凝膠滲透色譜法（GPC）兩種前處理技術，探討了前處理過程中目標化合物背景污染的來源。最終采用乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）超聲提取，經(jīng)GPC凈化后進行超高效液相色譜串聯(lián)質譜分析。3種目標化合物的線性范圍為0.25～1600

1 引 言

雙酚A（Bisphenol A， BPA）、壬基酚（Nonylphenol， NP）和辛基酚（Otcylphenol， OP）已被證明具有內(nèi)分泌干擾效應\\，BPA作為生產(chǎn)塑料的原料，NP和OP作為增塑劑和表面活性劑原料等被廣泛用于各種產(chǎn)品，可通過多種途徑污染食品。目前在純凈水以及魚蝦等水產(chǎn)品\\、肉及肉制品\\、奶類\\及谷物\\等多種食物中都檢測到這類物質。BPA、NP和OP的親脂性較強，易在高脂肪、高蛋白的動物性食品中富集。聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）專家會議\\對30篇文獻進行調(diào)研，發(fā)現(xiàn)高脂肪食物中BPA的含量高于其它食物; Lu等\\對臺灣466件食品進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)肉類的NP和OP含量高于其它食品。監(jiān)測BPA等污染物在動物性食品中的存在水平具有重要意義。

NP和BPA在環(huán)境中普遍存在，有研究者報道MilliQ超純水中BPA的濃度約為1～8 pg/L\\。此外，樣品預處理實驗用塑料器皿和橡膠制品等都會遷移出大量NP和BPA\\，對分析結果造成干擾。Kuch等\\在對地表水和飲用水中的環(huán)境雌激素酚類物質進行分析時，用二次蒸餾水或反滲透水作為質量控制樣品，結果在過程空白中檢出200～400 pg/L的OP、NP和BPA。在食品分析方面，盡管目前已有大量的文獻報道了檢測方法，但是有關分析過程中的質量控制涉及較少，其后果可能導致監(jiān)測數(shù)據(jù)失真，造成評估過程中食品安全風險的誤判。鑒于此，本實驗在探討不同樣品處理過程提取效果的同時，考察了實驗操作中目標化合物背景污染的來源，最終采用凝膠滲透色譜（GPC）凈化，同位素稀釋超高效液相色譜串聯(lián)質譜技術（UPLCMS/MS）分離檢測，實現(xiàn)了肉、蛋、奶中痕量BPA、NP及OP的同時測定。

2 實驗部分

2.1 儀器和試劑

Waters ACQUITYTM超高效液相色譜儀、XevoTM TQ質譜儀（美國Waters公司）; MilliQ超純水機（美國Millipore公司）; CHIST ALPHA24， LDplus型凍干儀（德國CHIST公司）; BüCHI MixerB400均質器（瑞士BüCHI公司）; Accuprep MPS凝膠滲透色譜儀（美國J2 Scientific公司）; 4011型數(shù)字旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）; SepPak NH2（500 mg， 6 mL），SepPak Silica（500 mg， 6 mL）和SepPak Florisil（500 mg， 6 mL）固相萃取柱（美國Waters公司）; Varian NH2（500 mg，6 mL）固相萃取柱（美國Varians公司）; Cleanert NH2，Cleanert PSA，Cleanert Silica，Cleanert Florisil，Cleanert PestiCarb和Cleanert Alumina N填料（天津Agela Technologies公司）; Supelclean LCFlorisil填料（美國Supleco公司）。

甲醇（LCMS級，德國Merck公司），乙腈、乙酸乙酯、環(huán)己烷、甲基叔丁基醚、丙酮和正己烷（HPLC級，美國Dikma公司）; 無水Na2SO4（分析純）; 氨水（28%～30%，w/w， 比利時Acros Organics公司）; 雙酚A（98.5%，德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司），4NP（日本Tokyo Kasei Kogyo公司），4OP（99%，美國SigmaAldrich公司）; 同位素內(nèi)標BPAd4，4nNPd4和4nOPd17（純度均大于97.8%，加拿大CDN公司）。

2.2 標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg標準品，以甲醇溶解并定容至10 mL，配制成1000 mg/L的標準儲備液，于20 ℃保存。臨用時用甲醇稀釋成不同濃度的標準工作液，于4 ℃保存。

2.3 樣品前處理

動物肌肉樣品用組織搗碎機搗碎均勻，雞蛋去殼后于100 mL燒杯中用玻璃棒攪拌均勻，液態(tài)奶樣品冷凍干燥后研磨均勻，奶粉樣品直接稱取。分別稱取肌肉、雞蛋和奶粉樣品4.0、4.0和2.0 g，于50 mL玻璃離心管中，加入10 mL乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）渦旋混勻，超聲提取15 min，于4 ℃以3000 r/min離心15 min，取5 mL上清液用于GPC凈化。GPC采用苯乙烯樹脂Biobead SX3 （300×10 mm）凝膠色譜柱，流動相為乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V），流速3.0 mL/min。收集12.5～17.5 min組分于100 mL雞心瓶中，在30 ℃以120 r/min旋轉蒸發(fā)至干，加1 mL甲醇。

 分 析 化 學第40卷

第4期牛宇敏等： 同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質譜法測定動物性食品中的雙酚A、壬基酚及辛基酚 

實驗中所用的器具均為玻璃材質，使用前在馬弗爐中400 ℃烘烤4 h。GPC及液相色譜串聯(lián)質譜儀的管線均為不銹鋼或聚四氟乙烯材質。每10個樣品做一個溶劑空白。

2.4 色譜質譜條件

色譜和質譜分析條件采用本課題組已建立的方法\\。色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18 （50 mm×2.1 mm，1.7 g/kg，放置30 min。乙腈、甲醇及甲基叔丁基醚處理肌肉和雞蛋等含水基質時，需加入無水Na2SO4脫水后，再超聲提取，取1 mL直接上機測定。使用乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）直接提取時，超聲離心后取1 mL上清液旋轉蒸發(fā)至干，以1 mL甲醇復溶再測定。結果如圖1所示，4種提取液中，除甲基叔丁基醚提取效率較差外，其余3種提取液的提取效率相差不大，均在62.3%～117.8%之間。乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）的回收率最高，乙腈略優(yōu)于甲醇。因此采用固相萃取凈化時，選擇乙腈作為提取液，GPC凈化時選擇乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）。

圖1 不同提取液對肌肉（A）、雞蛋（B）和奶粉（C）中目標化合物的回收率

Fig．1 Recoveries of target compounds in muscle （A）， egg （B） and infant formula （C） using different extracting solutions

1. 乙酸乙酯環(huán)己烷（Ethyl acetatecyclohexane， 1∶1，V/V）; 2. 乙腈（Acetonitrile）; 3. 甲醇（Methanol）; 4. 甲基叔丁基醚（Methyl tertiary butyl ether）。 

3.3 凈化方式的優(yōu)化

3.3.1 固相萃取法 在測定實際樣品時，無論以乙腈，還是乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）為提取液時，直接旋轉蒸發(fā)濃縮后都有明顯的脂肪殘留，LCMS/MS測定時產(chǎn)生了很強的基質抑制，NP和OP均大于70%（表1）。正相固相萃取是動物源性食品中痕量殘留物富集凈化常用的方法。本實驗比較了NH2柱、Silica柱和Florisil柱。在空白對照中均檢出NP，NH2柱和Florisil柱約為3 ng，Silica柱約為100 ng。

本研究以NH2柱為例，分別用10， 20， 30， 40和50 mL的甲醇丙酮（1∶1，V/V）預淋洗柱子，NP的背景值未明顯減少，說明大體積的洗脫液不能有效去除NP的干擾。本研究對固相萃取柱的不同組成部分進行了考察，即柱套、篩板以及填料。將常用的塑料柱套換成了玻璃柱套; 取不同的填料（0.5 g）和篩板分別浸泡在5 mL甲醇丙酮（1∶1，V/V）溶液中，每隔1 h取1 mL浸泡液進行測定; 棄去剩余溶液，重新加入5 mL甲醇丙酮（1∶1，V/V）溶液，以考察NP和BPA的溶出情況。本研究比較了7種填料，包括Cleanert NH2，Cleanert PSA，Cleanert Silica，Cleanert Florisil，Cleanert PestiCarb，Cleanert Alumina N和Supelclean LCFlorisil，發(fā)現(xiàn)隨著浸泡時間的延長，填料中釋放出的NP逐漸減少，最后維持在約0.4 ng; 但是篩板中NP會持續(xù)溶出，濃度約為0.8 ng，因此直接使用商品化的固相萃取柱進行凈化不可行。

本實驗參考了文獻\\，將Florisil填料于130 ℃加熱16 h可去除NP（NP溶出量低于0.1 ng）。稱取奶粉2.0 g，以10 mL乙腈提取一次，用10 mL乙腈飽和的正己烷進一步去除脂肪，取乙腈層旋轉蒸發(fā)至干，加5 mL正己烷丙酮（8∶2，V/V），轉入放有1.0 g Florisil填料的玻璃離心管中，2500 r/min漩渦振蕩1 min，離心后取上清液，旋蒸至干，定容并檢測，基質抑制率仍然大于50%（表1），該方法不能達到凈化目的。

表1 不同凈化處理后奶粉中目標化合物的基質抑制率

Table 1 Matrix suppression of target compounds in infant formula after different cleanup procedures （n＝3）

方法 MethodBPA（%）NP（%）OP（%）Ⅰ267779Ⅱ37152Ⅲ740 Ⅰ： 提取液直接濃縮（Extracts directly concentrated）; Ⅱ： Florisil填料凈化（Purified by Florisil）; Ⅲ： GPC凈化（Purified by GPC）。BPA: Bisphenol; NP: Nonylphenol; OP: Octylphenol。

3.3.2 凝膠滲透色譜法 GPC對含油脂類的樣品具有良好的凈化效果，本課題組曾用GPC方法檢測了植物油中目標化合物\\，發(fā)現(xiàn)GPC過程中引入的NP低于儀器的檢出限，由于該操作自動化程度高，因此背景值相對穩(wěn)定，RSD＜13%。本實驗中，樣品經(jīng)乙酸乙酯環(huán)己烷（1∶1，V/V）提取，GPC凈化后，脂肪的去除率高于90%，3種目標化合物的基質抑制率均大于10%（表1）。所以最終采用GPC進行樣品凈化。