摘 要 采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了大豆Em（LEA1）蛋白保守基序EmC和Em2M多肽在不同環(huán)境中的結構及聚集行為。研究表明，在水和DMPG溶液中，兩種多肽主要以無規(guī)結構形式存在。在50% TFE 溶液中，EmC多肽折疊結構增加，含疏水殘基的部分區(qū)域可能形成α螺旋結構，且分子以二聚體形式存在；而Em2M則以單體形式存在，且有序結構較少。以上結果表明，環(huán)境變化可能導致兩種多肽的空間結構和聚集行為改變，這有助于理解Em蛋白在不同環(huán)境中的結構特點，及其重要區(qū)域在全長蛋白中所起的作用。

關鍵詞 晚期胚胎發(fā)生富集（LEA1）蛋白； 核磁共振； 結構； 聚集

1 引 言

晚期胚胎發(fā)生富集（Late embryogenesis abundant，LEA）蛋白是一類與植物抗逆反應相關的重要蛋白質。根據其表達模式和序列特點，可將其分為7組\\。其中第一組LEA蛋白（簡稱為LEA1）全長序列高度保守，富含甘氨酸和帶電氨基酸，且在氨基端、中部和羧基端分別存在不同20氨基酸基序\\。LEA1蛋白主要存在于植物界中，在一些細菌和甲殼綱動物，如豐年蝦等生物體中也發(fā)現(xiàn)了此類蛋白\\。已有研究表明，小麥PM1959、大豆Em和小麥TaEm蛋白（LEA1）的表達可以提高多種生物（如轉基因植物、酵母和大腸桿菌重組子）對干旱、高鹽和滲透等脅迫的耐受性\\。體外實驗證明，小麥Em和大豆Em等（LEA1）可保護乳酸脫氫酶（LDH）或檸檬酸合成酶免于因高溫、干燥和冰凍脅迫所引起的酶活性喪失\\，LEA1蛋白可能具有多重保護功能。因此，揭示LEA1蛋白的保護功能，理解其作用機理，可為有效利用LEA基因，培育抗逆植物新品種提供重要的基礎資料。

在天然狀態(tài)下，LEA蛋白為無規(guī)結構蛋白\\。Tunnacliffe等\\指出，LEA蛋白結構的可塑性可能是實現(xiàn)多功能的重要基礎。在水溶液中， LEA1蛋白多以自由卷曲和少量α螺旋結構存在。當遇干燥脅迫或在醇溶液中，LEA1蛋白的α螺旋含量增多，預示著LEA1蛋白的α螺旋結構將參與對細胞的保護作用\\。小麥Em蛋白（LEA1）N端的α螺旋結構對經干燥脅迫的酶活性的保護作用是必需的\\。因此，研究LEA1蛋白和其重要結構域的結構及其隨環(huán)境的變化，有助于揭示在各種環(huán)境脅迫下LEA1蛋白與其它分子間可能發(fā)生的相互作用，及保護生物大分子等過程。

大豆Em蛋白屬LEA1蛋白，可編碼105個氨基酸，其中的第44～63位氨基酸為保守的中部20氨基酸基序（EmM區(qū)），該基序前面有43個氨基酸片段（EmN區(qū)），基序后面有42個氨基酸片段（EmC區(qū)）。本課題組最近報告，大豆Em蛋白全長蛋白、EmC、Em2M（含2個M區(qū)）和EmN片段的表達均可賦予重組大腸桿菌對高鹽的耐受性，而且還可以通過穩(wěn)定LDH酶蛋白結構、阻止其聚集而保護凍融脅迫下的LDH酶活性\\。

為了認識Em蛋白和其保守結構域的結構，及其隨環(huán)境變化的特點，并為進一步理解其重要區(qū)域在全長蛋白中所起的作用提供有用的結構信息，本研究采用圓二色譜（CD）和核磁共振波譜（NMR）方法研究了EmC和Em2M多肽在水、50% TFE溶液和陰性脂質體（DMPG）等不同環(huán)境下的結構和聚集行為。2 實驗部分

2.1 材料

多肽EmC和Em2M（表1）的表達、純化及鑒定參見文獻 \\。氘代三氟乙醇（TFEd2；98%，Cambridge Isotope Laboratories公司）；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油（DMPG，Avanti Polar Lipids Inc公司）；氯仿和甲醇（東莞市東江化學試劑有限公司）。

表1 多肽氨基酸序列（50個氨基酸）

Table 1 Sequence of peptides （50 amino acid）

M domain of soybean LEAI protein Em （Em2M）GSHMASGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSGGQTRKEQLGTEGYQEMGRKTSC domain of soybean LEAI protein Em （EmC）GSHMASGGLSTVDKSGEERAQEEGIGIDESKFRTGNNKNQNQNEDQDKTS

2.2 分析方法

2.2.1 遠紫外圓二色譜（FarUV CD） （1）樣品制備 A. 水溶液中樣品：將適量肽直接溶于20 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）中，使肽的終濃度為7

mol/L，磷脂與肽的濃度比為100∶1，混合溶液在35 ℃水浴中超聲1 h。（2） 儀器 Jasco J815圓二色譜儀。石英比色皿光程為0.1 cm，波長范圍190～250 nm；帶寬1.0 nm；所有實驗均在20 ℃進行。每個樣品掃描2次，每張譜圖取2次的平均值。所有肽膜體系的譜圖均為經過扣除單獨的磷脂膜（背底）后的結果，以平均殘基摩爾橢偏率θ表示：

θ＝θobs10lcn（1）

θobs是實驗所測的橢偏率（mdeg），l是石英比色皿的路徑長度（cm），c是肽的濃度（mol/L），n是多肽所含氨基酸個數(shù)。

蛋白質二級結構是通過CDPro軟件進行分析得到的。軟件由3個常用的程序SELCON3， CDSSTR和CONTIN組成。以48個參考蛋白對CD譜進行分析，并取3種程序計算結果的平均值。

2.2.2 核磁共振波譜 樣品制備：將適量的EmC和Em2M多肽分別溶于50% TFEd2溶液，使多肽的終濃度為2.88 mmol/L。

用于結構測定的核磁實驗均在布魯克AVANCE 600 MHz核磁共振波譜儀上完成，探頭為配備了X， Y， Z梯度線圈的5 mm三共振反式探頭。選用TSPd4作為內標。實驗溫度為298 K，所有二維1H譜均采用了壓水峰技術。TOCSY和NOESY實驗采用儀器自帶的標準脈沖序列進行采樣，混合時間分別為100和200 ms。采樣數(shù)據矩陣2048

512，累加96～168次。采用標準Bruker軟件（XWINNMR 3.5版本）進行譜圖處理，處理后的譜圖用SPARKY軟件進行分析。

 

擴散排序（DOSY）核磁共振實驗在配備有Z軸梯度場的三共振反向檢測探頭的布魯克AVANCE 500MHz核磁共振波譜儀上完成，實驗溫度為298 K。肽擴散系數(shù)的測定采用了含有WATERGATE壓水峰技術的BPPSTE（Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo）脈沖序列。水或TFE擴散系數(shù)的測定采用不含壓水峰技術的STE（Stimulated Echo）脈沖序列。