摘 要 分光光度法應(yīng)用于磷酸鹽長期監(jiān)測存在絡(luò)合物對透光窗口附著污染的干擾問題。本研究采用新的脈動變光程的分光光度檢測原理， 提出自標(biāo)定檢測方法， 開發(fā)了脈動可變光程的機械裝置。利用此設(shè)備實現(xiàn)了水體磷酸鹽檢測的長期原位自標(biāo)定。利用本方法與傳統(tǒng)分光光度計進行長期監(jiān)測對比實驗， 結(jié)果表明：本方法能夠有效去除鏡頭附著污染等干擾因素影響， 提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性。

關(guān)鍵詞 分光光度法； 磷酸鹽； 脈動變光程

1 引 言



磷是生物能量傳輸和動植物、浮游生物生長必需的營養(yǎng)要素， 水體中的氮和磷的濃度及其比值顯著影響浮游植物的豐度及種類。磷的生物可利用性可能直接影響到全球海洋初級生產(chǎn)力水平\\。因此， 磷酸鹽含量是生物地球化學(xué)過程的關(guān)鍵參數(shù)， 而活性磷酸鹽是研究磷在水體中循環(huán)的最關(guān)鍵參數(shù)。

目前， 實驗室的活性磷酸鹽檢測方法主要有磷鉬黃分光光度法、磷鉬藍（Phosphomolybdenum blue， PMB）分光光度法及流動注射分光光度法等\\。由于在磷酸鹽長期在線監(jiān)測過程中， 有色絡(luò)合物會累積附著在透光窗口上， 導(dǎo)致測量得到的透射光強度減弱， 從而使檢測結(jié)果偏離標(biāo)定曲線， 產(chǎn)生檢測誤差?？朔猩j(luò)合物附著污染的有效方法是對儀器進行定期標(biāo)定。但長期在線標(biāo)定存在以下的問題：（1）現(xiàn)場環(huán)境一般難以在線標(biāo)定， 并且標(biāo)準(zhǔn)溶液也難以在線長期保存；（2）標(biāo)定只能保障特定時刻數(shù)據(jù)檢測的準(zhǔn)確性， 而無法保障介于兩次標(biāo)定之間的檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。已有研究者基于改進試劑的保存狀態(tài)和條件， 解決了傳統(tǒng)分光光度法所需的試劑保存有效期較短的問題\\， 但是并沒有解決絡(luò)合物附著污染帶來的干擾問題。有研究者提出在數(shù)據(jù)處理中對監(jiān)測數(shù)據(jù)進行線性補償?shù)姆绞剑?去除在長期監(jiān)測中因有色絡(luò)合物污染透光窗口導(dǎo)致光強減弱的干擾\\。但是這種方法只對特定場所的勻速漸變附著有效， 而現(xiàn)場絡(luò)合物附著往往是階段性突變過程， 所以該補償方法不具有通用性。再者， 絡(luò)合物在透光窗口沉積與磷酸鹽樣品濃度及檢測頻率有關(guān)。因此， 該線性補償?shù)姆椒ú⒉荒軐嵸|(zhì)解決干擾問題。

針對活性磷酸鹽長期原位監(jiān)測問題的瓶頸， 本研究提出一種新的方法——脈動變光程檢測， 即將分光光度檢測的光程分為多等分的脈動量， 當(dāng)檢測光程變化一個或多個脈動量時， 檢測裝置動態(tài)記錄測量的吸光量。該原理引入一個穩(wěn)定的檢測光程變化量ΔL， 而測量的吸光量的變化量僅與ΔL、待測物濃度與吸光常數(shù)相關(guān)。因此， 其它干擾因素， 如光源漂移、有色絡(luò)合物附著等， 則可視為不變量被除去。2 檢測原理

如果在較短時間內(nèi)， 改變檢測光通過待測物的吸光光程（L）， 也就是恒壓改變檢測容腔的容積， 而保持待測物溫度、壓力、濃度（c）等不變， 由于絡(luò)合物附著擾動是一個相對長期緩慢變化過程， 因此在前后相鄰的檢測過程中可視為不變量。則脈動變光程后待測物的光程變化了ΔL。根據(jù)朗伯比爾定律， 上述過程可表示為：

I2＝I0·e

3 實驗部分

3.1 儀器與試劑

CHEM4VISFIBER分光光度計（Ocean optics）；脈動變光程分光光度系統(tǒng)（自制， 圖1）。CHEM4VISFIBER分光光度計覆蓋430～990 nm的光譜范圍， 光學(xué)分辨率為1.0 nm， 通過RS232串行接口可將光強數(shù)據(jù)發(fā)送給數(shù)據(jù)接收端。CHEM4VISFIBER通過準(zhǔn)直鏡和光纖， 可以實現(xiàn)將其光源和探測器應(yīng)用于脈動變光程分光光度系統(tǒng)。

6.0 mol/L H2SO4（分析純）；鉬酸銨溶液：溶解28 g鉬酸銨（分析純）于200 mL水中；酒石酸銻鉀溶液：溶解6 g酒石酸銻鉀（分析純）于200 mL水中， 貯于聚乙烯瓶中；混合溶液：邊攪拌邊將45 mL鉬酸銨溶液加到200 mL 6.0 mol/L H2SO4中， 加入5 mL酒石酸銻鉀溶液， 混勻， 貯于棕色玻璃瓶中；抗壞血酸溶液：溶解20 g抗壞血酸（分析純）于200 mL水中， 盛于棕色聚乙烯瓶中；磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液（0.300 g/L P）：稱取1.318 g6.0 mol/L KH2PO4（優(yōu)級純）溶于10 mL 6.0 mol/L H2SO4及少量水中， 全量轉(zhuǎn)入1000 mL量瓶， 定容， 混勻， 再加1 mL三氯甲烷（分析純）；磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（3.00 mg/L P）：量取1.00 mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液至100 mL量瓶中， 定容， 混勻， 加兩滴三氯甲烷。

3.2 脈動變光程分光光度系統(tǒng)

脈動變光程（PVOPL）分光光度系統(tǒng)主要由注射泵、多通閥、反應(yīng)池、廢液袋和脈動變光程裝置組成， 如圖1所示。系統(tǒng)通過注射泵和多位閥配合完成試樣的引入、預(yù)處理、反應(yīng)和檢測等， 采用自制的脈動變光程裝置， 利用CHEM4VISFIBER分光光度計的光源和檢測器， 完成濃度的檢測。

如圖1B所示， CHEM4VISFIBER分光光度計的光源和檢測器分別通過光纖經(jīng)過中空管8、9連接至準(zhǔn)直鏡14、15。光線依次經(jīng)過有機玻璃窗10、待測液腔3、有機玻璃5、空白液腔4和有機玻璃窗11組成的光程固定的光程池（設(shè)計長度300 mm）。有機玻璃5和有機玻璃窗10之間為待測液腔， 有機玻璃5

和有機玻璃窗11之間為空白液腔。步進電機轉(zhuǎn)動時， 通過絲桿螺紋帶動固定有有機玻璃5的套筒移

圖1 脈動變光程分光光度系統(tǒng)

Fig．1 Pulsating variable optical path length （PVOPL） spectrophotometric system

A: S. 樣品（Sample）；R. 試劑（Reagent）；SV. 多位選擇閥（Multiposition valve）；SP. 注射泵（Syring pump）；RC. 反應(yīng)池（Reactor Cell）；W. 廢液（Waste）; B: LS. 光源（Light source）；D. 檢測器（Detector）；1，2. 待測/空白液出入口（Sample/Blank inlet/Outlet）；3，4. 待測/空白液腔（Sample/Blank cell）；5. 有機玻璃（Organic glass）；6. 步進電機（Stepper motor）；7. 絲桿（Screw rod）；8，9. 中空柱塞（Hollow plunger）；10，11. 有機玻璃窗（Organic glass window）；12，13. 密封圈（ORing）； 14，15. 準(zhǔn)直鏡（Collimator）。

動， 改變待測液腔3和空白液腔4的大小， 從而改變待測液光程。步進電機的動作通過微控制器控制?？刂栖浖⒐獬坛胤譃?0等分， 最小光程差為30 mm。

3.3 檢測方法和步驟

3.3.1 磷鉬藍分光光度法 在酸性介質(zhì)中， 活性磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng)生成磷鉬黃， 用抗壞血酸還原為磷鉬藍后， 于882 nm波長測定吸光值。首先將SV1連通①③， 由注射泵吸入試劑， 再將SV1連通①④， 由注射泵將試劑注入反應(yīng)池。然后將SV1連通①②， 由注射泵吸入待測液， 再將SV1連通①④， 將待測液注入反應(yīng)池， 充分反應(yīng)后， 將SV2連通①③， 利用脈動變光程裝置進行檢測。檢測完畢后， 將SV2連通②③， 脈動變光程裝置將液體排出到廢液袋中。

3.3.2 繪制標(biāo)定曲線 量取0， 1.00， 1.50， 2.00， 2.50， 3.00和3.50 mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液于50 mL帶刻度具塞比色管中， 定容得到7個濃度梯度的磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液。上述溶液各加1.0 mL混合溶液， 1.0 mL抗壞血酸溶液， 混勻。顯色5 min后， 利用脈動變光程裝置進行測量， 空白溶液為蒸餾水?？刂撇竭M電機， 在某一濃度下， 測量光程在L0處的吸光值A(chǔ)0和光程在L1處的吸光值A(chǔ)