陳啟斌 莢衛(wèi)東

自1998年由Fire等[1]首次發(fā)現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象以來，RNA干擾技術(shù)發(fā)展迅速，RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引發(fā)的廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。

原發(fā)性肝癌是最常見的惡性腫瘤之一，是多因素、多階段、多基因相互作用的結(jié)果，包括病毒感染、致癌物的作用、癌基因的激活和抑癌基因的失活、細(xì)胞的凋亡和增殖調(diào)節(jié)失控、修復(fù)基因結(jié)構(gòu)和功能缺陷等[2]。在其癌變、增殖、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等一系列過程中伴隨著不同階段的癌基因或抑癌基因變異，引起相關(guān)因子表達(dá)的紊亂。針對(duì)這些生物學(xué)特性，已經(jīng)有許多RNA干擾技術(shù)應(yīng)用于肝癌的基因治療與研究。RNAi因其特有的高效性、特異性、低毒性，為肝癌基因治療的研究開辟了一條新的途徑。

一、RNAi概述

（一）RNAi的發(fā)現(xiàn) 1995年Guo等[3]人在阻斷秀麗新小桿線蟲中par-1基因表達(dá)的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)組注射正義RNA不但不增加該基因的表達(dá)，反而產(chǎn)生與反義RNA同樣的結(jié)果，即特異性阻斷該基因的表達(dá)。1998年，由Fire等[1]證實(shí)，正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象是由于體外轉(zhuǎn)錄的RNA中污染了少量dsRNA而引起的，并發(fā)現(xiàn)純化后的dsRNA具有比正義鏈或反義鏈更強(qiáng)的基因沉默效應(yīng)，故將dsRNA能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默的這一現(xiàn)象首次稱為RNAi現(xiàn)象。隨后在一些植物和低等無脊椎動(dòng)物中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)RNAi效應(yīng)存在[4]。早期研究者采用較長(zhǎng)序列的dsRNA總是導(dǎo)致基因的非特異性抑制，以致認(rèn)為在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是不能以RNAi技術(shù)誘導(dǎo)特異性基因抑制的[5]。2001年，Elbashir等[6]將人工合成的19-21nt的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）通過陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入人胚腎細(xì)胞和Hela細(xì)胞，成功地在哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生了特異性的基因沉默，解決了長(zhǎng)片段dsRNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引起非特異性干擾的問題，從此RNAi技術(shù)得以廣泛應(yīng)用于哺乳動(dòng)物和人類細(xì)胞的研究。

（二）RNAi的機(jī)制與應(yīng)用 在RNAi過程中，dsRNA被特異性核酸內(nèi)切酶（dsRNA specific endonuelease，Dicer）切割成約21-23nt的短雙鏈片段[7]，即siRNA。siRNA雙鏈3’端為羥基末端，且有兩個(gè)不配對(duì)的堿基，此結(jié)構(gòu)可能對(duì)siRNA形成蛋白復(fù)合體是必須的，兩端的5’-磷酸鹽是真正的siRNA和細(xì)胞其他dsRNA賴以區(qū)分的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。另外，siRNA的5’—磷酸鹽可能充當(dāng)靶RNA裂解位點(diǎn)的一種分子參照[8]。由siRNA中的反義序列指導(dǎo)形成一種蛋白復(fù)合體，該蛋白復(fù)合體被稱為RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物（RNA induced silencing conplex，RISC）。siRNA作為引導(dǎo)序列引導(dǎo)RISC與同源性的mRNA結(jié)合，解旋酶催化mRNA與siRNA的正義RNA鏈相互交換，反義RNA鏈與同源mRNA結(jié)合后，核酸酶在mRNA與反義RNA所形成的雙鏈區(qū)的5’起始端下游7-10個(gè)核苷酸處（也就是雙鏈區(qū)的靠近中間位置）切斷mRNA，導(dǎo)致其降解，阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)[9]。降解的mRNA被釋放后，siRNA雙鏈重新形成，可以繼續(xù)降解同源mRNA[10]。siRNA也可作為一種特殊引物，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA dependent RNA polymerase，RdRp）作用下，以靶mRNA為模板合成dsRNA[11]，后者再次被Dicer切割成siRNA，新生成的siRNA又可進(jìn)入上述循環(huán)，這一過程稱為RNAi的放大效應(yīng)。新生成的dsRNA被反復(fù)合成與降解，不斷產(chǎn)生大量新的siRNA，從而使靶mRNA漸進(jìn)性減少，有效抑制靶向基因蛋白質(zhì)或多肽合成，呈現(xiàn)基因沉默現(xiàn)象[12]。此外，siRNA本身也可在RdRp作用下進(jìn)行自我復(fù)制，使信號(hào)不斷擴(kuò)大，產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)，不斷引起相應(yīng)的mRNA降解。RNAi技術(shù)作為一種簡(jiǎn)便而又高效特異的抑制靶基因表達(dá)的新技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、抗病毒和抗腫瘤基因治療以及藥物開發(fā)等領(lǐng)域的探索之中[13]。

二、RNAi在肝癌治療研究中的應(yīng)用

（一）肝癌基因RNAi治療靶基因的選擇 通過RNAi技術(shù)作用于肝癌的發(fā)生、發(fā)展的各相關(guān)因素和多個(gè)階段中有重要作用的靶基因，調(diào)節(jié)基因間的相互作用是目前RNAi用于肝癌研究的主要方向。

RNAi在肝癌研究領(lǐng)域中可體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:（1）RNAi可應(yīng)用于敲除點(diǎn)基因突變激活的癌基因?；诟叨忍禺愋?，盡管突變基因和野生型基因通常只有一個(gè)不同的堿基，RNAi仍可對(duì)突變基因產(chǎn)生抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞中的野生型基因不產(chǎn)生抑制作用[14]；（2）RNAi可應(yīng)用于抑制插入基因及融合基因的表達(dá)；（3）RNAi可應(yīng)用于抑制基因擴(kuò)增?；驍U(kuò)增是指原癌基因通過某種機(jī)制在原染色體上復(fù)制出多個(gè)拷貝數(shù)，導(dǎo)致表達(dá)產(chǎn)物異常增多，細(xì)胞增殖。設(shè)計(jì)基因擴(kuò)增中起重要作用的基因siRNA或shRNA[即短發(fā)夾RNA，包含兩個(gè)短反向重復(fù)序列（其中一個(gè)與目的基因互補(bǔ)），中間由一個(gè)loop序列分隔，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在體內(nèi)shRNA可以被加工成siRNA，降解目的基因，可抑制目的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[15]；（4）RNAi可應(yīng)用于抑制其他與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)基因的表達(dá)，如腫瘤多耐藥基因；（5）RNAi可針對(duì)血管生成因子及其受體；（6）等位基因特異性抑制（ASI），ASI是一針對(duì)腫瘤細(xì)胞中與缺陷基因?qū)?yīng)的正常等位基因進(jìn)行治療的方法，其前提是該等位基因?qū)匐s合子并且是細(xì)胞生命活動(dòng)所必需的。抑制了正常等位基因的腫瘤細(xì)胞會(huì)死亡，而正常細(xì)胞由于等位基因的代償而不受影響。

Yin等[16]采用脂質(zhì)體法將單一或組合的siRNA轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、肺腺癌細(xì)胞、卵巢癌細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，siRNA不僅特異性清除了靶目標(biāo)如bcl-2、cdk-2、mdm-2、pkc-alpha、tgf-betal、H-ras、vegf和 GFP 的 mRNA，而且不同程度上抑制了癌細(xì)胞的增殖，從而證實(shí)這些人類腫瘤細(xì)胞內(nèi)都存在RNAi機(jī)制，他們認(rèn)為載體攜帶、化學(xué)合成的siRNA通過細(xì)胞內(nèi)RNAi體系使靶mRNA沉默，組合不同的siRNA可抑制癌細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。Li等[17]在研究IFN-gamma/LIGHT介導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號(hào)通路機(jī)制的同時(shí)，通過RNAi手段阻斷Hep3B細(xì)胞中Bcl-XL的過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在Hep3B細(xì)胞中Bcl-XL的過表達(dá)能增強(qiáng)對(duì)IFN-gamma/LIGHT介導(dǎo)凋亡的抵抗。Wu等[18]以人工合成的miRNAs介導(dǎo)的RNAi技術(shù)下調(diào)CC趨化因子受體（CCR）1基因在肝癌細(xì)胞系HCCLM3中的表達(dá)，可抑制HCCLM3細(xì)胞的侵襲能力，CCR1基因表達(dá)下降可顯著減少基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2的分泌，后者與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

腫瘤細(xì)胞增殖所需的能量，核酸合成所需的核苷酸均由磷酸戊糖途徑直接或間接產(chǎn)生，轉(zhuǎn)酮醇酶就是這一途徑的限速酶，原癌基因轉(zhuǎn)酮醇1（transketolase-like protein 1，TKTL1）是轉(zhuǎn)酮醇酶家族中的一員，其所定位的區(qū)域包含了許多與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和細(xì)胞周期有關(guān)的基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展上起到十分重要的作用[19]。Zhang等[20]通過RNAi技術(shù)在肝癌細(xì)胞中抑制TKTL1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)能明顯影響肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲活力，可望成為肝癌治療的新靶點(diǎn)。Sun等[21]通過RNAi抑制了人肝癌細(xì)胞系Bel-7402細(xì)胞系上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變因子（Twist1）基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力明顯下降。Salvi等[22]通過RNAi抑制了肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（c-Met）的表達(dá)，進(jìn)而抑制了肝癌SKHep1C3細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。陸彬彬等[23]以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）shRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，可阻斷大部分肝癌細(xì)胞VEGF蛋白的表達(dá)，細(xì)胞增殖能力降低，單個(gè)細(xì)胞克隆形成能力明顯下降。VEGF被公認(rèn)與肝癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，因此認(rèn)為，VEGFshRNA真核表達(dá)載體可應(yīng)用于肝癌的基因治療。

（二）肝癌基因RNAi治療干擾方式的選擇

（1）化學(xué)合成的RNAi：對(duì)于瞬時(shí)基因沉默實(shí)驗(yàn)，化學(xué)合成的、非載體的方法比載體法有著明顯的優(yōu)勢(shì)：化學(xué)合成的siRNA設(shè)計(jì)簡(jiǎn)易；操作簡(jiǎn)便；對(duì)細(xì)胞或組織的毒副作用較??；容易獲得高水平的瞬時(shí)沉默效果；特異性強(qiáng)；同樣的實(shí)驗(yàn)條件下，在不同實(shí)驗(yàn)室重復(fù)性高。但其穩(wěn)定性較差，作用時(shí)間較短。朱曉群等[24]通過化學(xué)合成骨橋蛋白特異性siRNA干擾高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞株HCC-LM3，可顯著降低骨橋蛋白的表達(dá)，且抑制了肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。陳鐘等[25]化學(xué)合成了PLK1基因的siRNA，轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細(xì)胞后，可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。

（2）載體介導(dǎo)的RNAi：基于DNA載體的siRNA可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，其特點(diǎn)有：產(chǎn)生shRNA來完成RNA干擾；方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，只需合成DNA寡核苷酸；克隆載體使用方便，帶有篩選標(biāo)記，可幫助建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系；shRNA質(zhì)粒穩(wěn)定，易于操作。檀英霞等[26]將肝素酶短發(fā)夾式RNA（Hpa-shRNA）真核表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞株HepG2（高表達(dá)Hpa）后，明顯抑制了肝素酶（Hpa）的表達(dá)，且接種于裸鼠皮下，可抑制體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。趙岳等[27]建立靶向N-ras基因的shRNA表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，可明顯抑制N-ras基因的表達(dá)，且誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Luo等[28]通過載體介導(dǎo)的shRNA干擾肝癌細(xì)胞中極低密度脂蛋白受體II（VLDLRII）的表達(dá)，使得肝癌細(xì)胞處于G0/G1期，抑制了細(xì)胞增殖。

（3）慢病毒介導(dǎo)的RNAi：慢病毒載體是一類重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，由于其結(jié)構(gòu)和功能的特點(diǎn)作為一種重要的基因轉(zhuǎn)移工具被應(yīng)用于基因治療和細(xì)胞分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，他對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。該載體可以將外源基因有效的整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表達(dá)。Huang等[29]通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默Smad4基因表達(dá)，干擾了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β-Smad4信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡。李俊等[30]采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)干擾人IKKα、IKKβ基因的表達(dá)，并且觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)IKKα、IKKβ基因的表達(dá)被沉默后，肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。

三、展望

原發(fā)性肝癌是我國(guó)發(fā)病率和復(fù)發(fā)率較高的惡性腫瘤之一，肝癌術(shù)后的高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率是目前肝癌治療的巨大挑戰(zhàn)。因此，研究肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于尋找有效治療方法具有重要的意義。RNAi為肝癌研究開辟了新途徑，其應(yīng)用于肝癌的治療正成為肝癌基因治療研究的新熱點(diǎn)。

[1]Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.Nature，1998，391，（6669）:806-811.

[2]Feitelson MA，Sun B，Satiroglu Tufan NL，et al.Genetic mechanisms of hepatocarcinogenesis.Oncogene，2002，21 （16）:2593-2604.

[3]Guo S，Kemphues KJ.Par-1，a gene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed.Cell，1995，81 （4）:611-620.

[4]AravinAA，KlenovMS，VaginVV，etal.Roleofdoublestranded RNA in eukaryotic gene silencing.Mol Biol（Mosk），2002，36（2）:240-251.

[5]Sui G，Soohoo C，Affarel B，et al.A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（8）:5515-5520.

[6]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cell.Nature，2001，411（6836）:494-498.

[7]Tobe K，Suzuki R，Aoyama M，et al.Increased expression of the sterol regulatory element-binding protein-1 gene in insulin receptor substrate-2（-/-） mouse liver.J Biol Chem，2001，276，42）:38337-38340.

[8]Nykanen A，Haley B，Zamore PD.ATP requirements and small interferings RNA structure in the RNA interference pathway.Cell，2001，107（3）:309.

[9]Mcmanus MT，Sharp PA.Gene silencing in mammals by small interfering RNAs.Nature Rev Genet，2002，3（10）:737-747.

[10]Elbashir SM，Lendecked W，Tuschl T.RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs.Genes，2001，15（2）:188.

[11]Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate eibonuclease in the initiation srep of RNA interference.Nature，2001，409（6818）:363-366.

[12]Semizarov D，F(xiàn)rost L，Sarthy A，et al.Specificity of short interferingRNA determined through geneexpression signatures.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（11）:6347-6352.

[13]Hannon GJ，Rossi JJ.Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.Nature，2004，431（7006）:371-378.

[14]Lieber CS，Leo MA，Mak KM，et al.Acarbose attenuates experimentalnon-alcoholicsteatohepatitis.Biochem BiophysRes Commun，2004，315（3）:699-703.

[15]Plasma C，Soardo G，Esposito W，et al.Plasma adiponectin is decreased in nonalcoholic fattyliverdisease.EurJEndocrinol，2005，152（1）:113-118.

[16]Yin JQ，Gao J，Shao R，et al.siRNA agents inhibit oncogene expression and attenuate human tumor cell growth.J Exp Ther Oncol，2003，3（4）:194-204.

[17]Li J，Shen F，Wu D，et al.Expression level of Bcl-XL critically affects sensitivity ofhepatocellularcarcinoma cells to LIGHT-enhanced and interferon-gamma-induced apoptosis.Oncol Rep，2007，17（5）:1067-1075.

[18]Wu X，F(xiàn)an J，Wang X，et al.Downregulation of CCR1 inhibits human hepatocellular carcinoma cell invasion.Biochem Biophys Res Commun，2007，355（4）:866-871.

[19]Coy JF，Dresslerd，Wilde J，et al.Mutations in the transketolase-like gene TKTL1:clinical implications for neurodegenerative diseases，diabetes and cancer.Clin Lab，2005，51 （5-6）:257-273.

[20]Zhang S，Yang JH，Guo CK，et al.Gene Silencing of TKTL1 by RNAiinhibitscellproliferation in human hepatoma cells.Cancer Lett，2007，253（1）:108-114.

[21]Sun T，Zhao N，Zhao XL，et al.Expression and functional significance of twist1 in hepatocellular carcinoma:Its role in vasculogenic mimicry.Hepatology，2009，50（12）:1-12.

[22]Salvi A，Arici B，Portolani N，et al.In vitro c-met inhibition by antisense RNA and plasmid-based RNAi down-modulates migration and invasion of hepatocellular carcinima cells.Int J Oncol，2007，31（2）:451-460.

[23]陸彬彬，殷詠梅，王朝霞，等.人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子SHRNA真核表達(dá)載體對(duì)肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的增殖影響.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，26（6）:403-406.

[24]朱曉群，葉青海，雷科峰，等.特異性小干擾性RNA降低骨橋蛋白基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲性的影響.中華腫瘤雜志，2006，28，6）:404-407.

[25]陳鐘，陳小建，常仁安，等.RNA干擾PLK1基因表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的影響. 中國(guó)普通外科雜志，2010，9（19）:1001-1004.

[26]檀英霞，劉志玄，李素波，等.RNA干擾對(duì)肝素酶在肝癌細(xì)胞中表達(dá)及其腫瘤生長(zhǎng)抑制的作用.世界華人消化雜志，200816（2）:138-143.

[27]趙岳，徐凱成，張燕菊，等.RNA干擾抑制人肝癌細(xì)胞N-RAS基因表達(dá)的研究. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（2）:177-179

[28]Luo M，Liu YJ，Xia LM，et al.Very low density lipoprotein receptor subtype II silencing by RNA interference inhibits cell proliferation in hepatoma celllines.Hepatogatroenterology，2010，57（101）:882-890.

[29]Huang S，Zhang F，Miao L，et al.Lentiviral-mediated Smad4 RNAi induced anti-proliferation by p16 up-regulation and apoptosis by caspase 3 down-regulation in hepatoma SMMC-7721 cells.Oncol Rep，2008，20（5）:1053-1059.

[30]李俊，孫倍成，鄧?yán)?，?針對(duì)人IKKα、IKKβ基因RNA干擾慢病毒質(zhì)粒的構(gòu)建及其對(duì)人肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響.江蘇醫(yī)藥，2009，35（1）:75-77.