劉文英，張永芳，張東旭

（山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009）

植物抗寒基因研究進展

劉文英，張永芳，張東旭

（山西大同大學(xué)農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山西大同 037009）

低溫是一種常見的非生物脅迫，是限制植物分布、降低作物產(chǎn)量及品質(zhì)的重要原因之一，是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種嚴(yán)重的自然災(zāi)害。隨著植物抗寒分子機理的不斷深入研究，目前已經(jīng)克隆了很多植物抗寒相關(guān)基因，可通過基因工程手段提高植物的抗寒性，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要意義。本文綜合概述了目前已克隆的重要植物抗寒基因的最新研究方向、進展及應(yīng)用。

植物；低溫；抗寒性；基因

低溫是植物所面臨的重要的逆境因子。低溫不僅會限制植物的廣泛分布，在低溫環(huán)境下，植物的生長發(fā)育會受到嚴(yán)重影響，會引起植物內(nèi)發(fā)生一系列的不良生理代謝反應(yīng)，直接導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降，甚至?xí)鹬仓甑乃劳?。全世界每年由于低溫造成的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟損失可達到數(shù)千億元［1］。植物只能生長在特定的環(huán)境中，不能像動物一樣通過移動而躲避嚴(yán)寒，而是有自己獨特的耐寒機制?？寺≈匾秃虿粌H能更好地了解植物的生長發(fā)育分子調(diào)控機制，而且可以通過生物工程技術(shù)來提高植物的耐寒性，具有重要的理論實踐意義。20世紀(jì)80年代，由于分子生物技術(shù)的引入，克隆了大量抗寒相關(guān)基因，通過轉(zhuǎn)基因驗證，發(fā)現(xiàn)其中部分基因?qū)μ岣咧参锏哪秃云鹬匾饔茫?-3］。

1 冷誘導(dǎo)基因

冷誘導(dǎo)基因（COR基因）是一類在低溫下才被誘導(dǎo)或大量表達的基因，這些基因的表達使植株表現(xiàn)出一定的抗寒能力。在適合植物生長的正常溫度范圍內(nèi)，COR基因的表達量通常很低甚至不表達，此時植物的抗寒能力僅是一種可開發(fā)的潛能。至今，已從擬南芥、大麥、油菜、苜蓿、菠菜等植物中鑒定出大量冷誘導(dǎo)基因大約有上百種［4］，如cor15a，Bn28，cor78/rd29A，cor6.6/kin2，cor47/rd17，wcs120、kin1等，并對這些基因在低溫下的表達調(diào)控及編碼蛋白在抗寒過程中的作用機制等問題進行了研究。

盡管這些COR基因來自于各種不同的植物，卻表現(xiàn)出許多相同的特征，COR基因的表達產(chǎn)物，大多具有極強的親水性，許多還包含一段特殊的區(qū)域，能夠形成親水脂性的α-螺旋。目前已經(jīng)克隆的冷誘導(dǎo)基因都含有一個共同的調(diào)控元件，其具體序列為CRT（TGGCCGAC）/DRE（TACCGACAT），作為順式作用的啟動子元素，能在低溫脅迫時激活COR基因的表達，使植物不需經(jīng)過冷馴化就具有抗凍性。COR基因主要由4個基因簇組成，每個基因族又是由2個基因一前一后串聯(lián)組成。其中COR15，COR78和COR616家族的偶基因能編碼新的多肽，而COR47家族的偶基因則編碼LEAⅡ類蛋白的類群蛋白［5］。

大多數(shù)冷誘導(dǎo)基因除受低溫應(yīng)答外，還對一些其他脅迫也作出應(yīng)答，如高鹽、ABA、干旱、滲透等。對COR基因進行的誘導(dǎo)調(diào)控主要在3方面進行，有發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上的，有發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平的，還有的在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后兩個水平都進行調(diào)節(jié)。低溫可以誘導(dǎo)許多基因的大量表達，目前已經(jīng)建立了很多植物的低溫誘導(dǎo)cDNA文庫，包括水稻、擬南芥、大麥、小麥、苜蓿、菠菜等。很多轉(zhuǎn)基因研究表明，導(dǎo)入冷誘導(dǎo)基因能夠提高植物抗寒性的能力。目前大多數(shù)抗寒基因來自擬南芥等模式作物，仍有很多抗寒基因表達調(diào)控機制及編碼蛋白質(zhì)的抗寒機理還需要進一步深入研究。

2 抗寒相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

植物在遭受低溫脅迫時，從感受到低溫信號到產(chǎn)生一定的抗寒能力，這個過程中存在一個復(fù)雜的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，會引發(fā)一系列的生理生化反應(yīng)，使耐寒相關(guān)的基因大量表達，這些都受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。最近，與抗寒性相關(guān)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子基因克隆及其表達調(diào)控已經(jīng)取得一些進展，它能誘導(dǎo)多個或成組相關(guān)抗寒反應(yīng)基因表達。了解的比較清楚的有CBF調(diào)控因子（CRT/DRE-binding factor），可誘導(dǎo)一百多個基因的表達［6-7］。

CBF轉(zhuǎn)錄因子是一類受低溫誘導(dǎo)的反式作用因子，1997年首次從模式作物擬南芥中分離鑒定出CBF1［8］，這種轉(zhuǎn)錄因子具有特異地識別COR基因啟動子部分的順式作用元件CRT/DRE基序，并且結(jié)合上去。CBF基因家族又分為幾大類，主要包括CBF1，CBF2，CBF3，CBF4，CBF5和CBF6。DNA序列分析表明，CBF家族中的4個成員其基因閱讀框架中都不包括內(nèi)含子序列，其中CBF1，CBF2和CBF3基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的同源性為88％，相似性高達91％。4種蛋白質(zhì)中都有相同的結(jié)構(gòu)AP2結(jié)構(gòu)域基序。在常溫條件下，植物體內(nèi)的CBF基因表達量很低甚至為零，在低溫條件下，表達量會大量增高。它的信號傳導(dǎo)途徑是：CBF轉(zhuǎn)錄因子→CRT/DRE基序→COR基因表達→植物抗寒性增加，即轉(zhuǎn)錄因子CBF作為反式作用因子，首先識別COR基因啟動子部分的順式作用元件CRT/DRE序列，并結(jié)合上去，通過調(diào)控誘導(dǎo)COR基因的表達量明顯升高，從而提高了植物的抗寒性［9］。有研究表明，將外源CBF1基因轉(zhuǎn)入到未經(jīng)冷馴化的擬南芥中，經(jīng)檢測轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中的CBF基因的表達量明顯高于野生型植株，即使在常溫下也能誘導(dǎo)COR基因的大量表達，而野生型植株的COR基因在常溫下表達量很低，增強了擬南芥的抗寒能力。擬南芥CBF3基因的過量表達，導(dǎo)致了一系列與低溫脅迫應(yīng)答相關(guān)的各種生理生化變化，也提高了轉(zhuǎn)基因植株的抗寒能力。

3 脂肪酸去飽和酶基因

當(dāng)植物受到低溫脅迫時，細胞膜是受到脅迫傷害的原初位點。在低溫條件下，膜脂從液相變成凝膠相，脂膜上的脂肪酸鏈由無序排列變?yōu)橛行蚺帕?，生物膜的脂類會出現(xiàn)相變和分離，從而引起使酶亞基分解或與膜結(jié)合的酶解離，而使酶活性降低甚至喪失。由于膜脂的相變和膜蛋白的解離，使膜上出現(xiàn)了裂痕，使細胞膜的通透性不同程度的增大，胞內(nèi)溶質(zhì)外滲，細胞內(nèi)相應(yīng)的酶系統(tǒng)和代謝過程遭到破壞，打破離子平衡，引起代謝失調(diào)。有研究表明膜的不飽和脂肪酸的不飽和度與含量越高，相變溫度就越低，就越有利于維持膜在低溫時的流動性，植物的抗寒性就越強。

GPAT是磷酰甘油生物合成過程中的第1個?；セ?，催化?；晒w向3-磷酸甘油的sn-1位轉(zhuǎn)移，對決定植物膜PG的不飽和度起關(guān)鍵作用。目前在水稻、黃瓜、豌豆、擬南芥等植物中都克隆到了GPAT基因。有研究表明，將外源GPAT基因分別轉(zhuǎn)入擬南芥和煙草中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中脂肪酸組成發(fā)生了改變，膜脂不飽和度明顯高于野生型植株，提高了植物的抗寒能力［10］。

脂肪酸去飽和酶（FAD）是脂肪酸代謝過程中的關(guān)鍵酶之一，其催化的反應(yīng)是將一部分飽和脂肪酸生成不飽和脂肪酸，也是不飽和脂肪酸合成途徑的關(guān)鍵酶之一。FAD能作用于細胞膜脂能降低細胞膜中飽和脂肪酸的含量，增加不飽和脂肪酸的含量，提高膜脂的不飽和度。在擬南芥、蓖麻、水稻、小麥、大豆等植物中都已克隆到了FAD基因。在模式植物擬南芥中最先克隆得到AtFAD7和AtFAD8基因，它們的核苷酸序列同源性高達75％，并且都與各自的葉綠體中的ω-3去飽和酶基因的功能互補，兩者配合起來共同作用，可催化膜脂中脂肪酸的去飽和作用。將外源FAD7基因轉(zhuǎn)到煙草中，進行低溫處理，發(fā)現(xiàn)提高了轉(zhuǎn)基因煙草中C18：3不飽和脂肪酸的含量，耐寒性也明顯增強［11］。近幾年，利用基因工程技術(shù)將脂肪酸去飽和代謝關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入到各種低溫敏感植物中，經(jīng)檢測植物細胞膜中脂肪酸的飽和度都有不同程度的降低，增強植物的抗寒性，培育出許多新的抗寒品種，取得了很多突破性的進展。

4 抗凍蛋白基因

當(dāng)溫度降低到零攝氏度以下時，會引起植物細胞外和細胞內(nèi)都結(jié)冰，稱為低溫凍害?？箖龅鞍祝ˋFP）是一類具有提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物的總稱，能以非依數(shù)的形式降低水溶液的冰點，能夠直接與冰晶進行相互作用，從而抑制冰晶的生長。AFP在20世紀(jì)60年代從南極和北極動物的血清中先發(fā)現(xiàn)的，能與冰晶特異性的結(jié)合，維持體內(nèi)液體的非冰凍狀態(tài)，當(dāng)受到零度以下的低溫時可使生物抵御冰凍環(huán)境。當(dāng)?shù)蜏貙?dǎo)致結(jié)晶生成時，抗凍蛋白變會活化，能特異地吸附于冰晶表面，抑制冰晶的重晶化，阻止晶格的形成，以及阻止小的冰晶結(jié)成更大的冰晶，從而減輕冰晶在凍融的動態(tài)變化中對生物體的傷害。一旦溫度回升，AFP又失去活性。

在許多耐凍的生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)抗凍蛋白的存在，AFP最早在極地海魚中發(fā)現(xiàn)的，在植物中起步較晚。極地魚類的抗凍蛋白基因結(jié)構(gòu)中有許多序列重復(fù)的多拷貝序列。將比目魚的AFP基因轉(zhuǎn)入到擬南芥、煙草、馬鈴薯和油菜等植物中，獲得了較好的抗寒效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的自然結(jié)冰平均溫度比野生型植株都有明顯的下降，平均降低了1.8℃，其中轉(zhuǎn)基因煙草的冰點下降最明顯，降低了3～5℃，說明了動物的AFP基因轉(zhuǎn)入到植物中可以提高植物的抗寒能力。1992年，加拿大Griffith首次在冬黑麥中發(fā)現(xiàn)了植物AFP蛋白，標(biāo)志著植物抗凍蛋白研究的開始。

目前，已經(jīng)在冬小麥、燕麥、冬黑麥、胡蘿卜、沙冬青、桃樹、甜楊等高等植物中分離到AFP蛋白。這些抗凍蛋白之間的相似性很低，它們的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量和同源性都不相同。抗凍蛋白中主要有7個多肽組分表現(xiàn)出了明顯的抗凍活性，其中5種多肽活性較高，且相對分子質(zhì)量較大分別為16，25，32，34，36kDa。植物的AFP蛋白，可通過冷馴化誘導(dǎo)獲得。1998年，從胡蘿卜中克隆到了第一個植物AFP基因。AFP基因的表達主要靠溫度控制，在正常狀態(tài)下AFP基因不表達，在冷馴化狀態(tài)下表達水平特異性的提高，以增加生物對寒冷的適應(yīng)能力。植物AFP可在冷誘導(dǎo)植物的根莖葉等器官中產(chǎn)生，也可在植物組織培養(yǎng)條件的愈傷組織和懸浮細胞中產(chǎn)生。2000年從冬黑麥的葉片中克隆得到具有幾丁質(zhì)酶活性的抗凍基因。AFP的特點是利用AFP的冰晶重結(jié)晶抑制效應(yīng)，與植物細胞膜相互作用，防止在低溫過程中細胞冷凍-解凍過程中得損傷。將胡蘿卜的AFP基因?qū)霟煵?，發(fā)現(xiàn)可以抑制煙草冰晶生長，增強其抗寒性，使植物具有抗凍能力。

植物的抗寒性是有多個基因控制的數(shù)量性狀，目前已經(jīng)克隆了一些抗寒基因并通過基因工程技術(shù)提高了植物的抗寒性。雖然植物抗寒相關(guān)領(lǐng)域已取得了一定的進展，但仍存在一些問題，植物的低溫反應(yīng)和抗寒分子機理不清，研究方法單一，表達系統(tǒng)不完善。目前一些尚未有定論的認識，如COR基因的具體功能及其調(diào)控方式如何、相變發(fā)生的溫度范圍、低溫信號是如何傳遞的、各種抗寒基因是怎樣表現(xiàn)出抗寒活性的、以及如何將外源抗寒基因轉(zhuǎn)到不耐寒植物中以提高其抗寒性等。今后的研究方向?qū)⒅饕铝τ诩訌娍购肿訖C理研究、克隆更多的抗寒相關(guān)基因、完善表達系統(tǒng)、豐富研究方法等方面。研究植物抗寒性的目的在于提高農(nóng)作物的抗寒性，實現(xiàn)通過抗寒基因表達和多種抗寒技術(shù)相結(jié)合來提高植物抗寒性這一目標(biāo)。

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〔責(zé)任編輯 楊德兵〕

Study on Cold Resistant Genes in Plants

LIU Wen-ying，ZHANG Yong-fang，ZHANG Dong-xu
（School of Agronomy and Life Science，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009）

Chilling temperature is an important environmental factor affecting plant distribution，yield and quality.It is important to improve the cold resistance of plants.In recent years，lots of plant cold resistant gene have been cloned due to the great advances in the research of molecular mechanisms of cold resistance.The studies of genetic engineering for cold resistance in plants have been carried out extensively.In this paper，recent progresses of plant cold resistant genes are summarized，including new research，application and brought forward.

plant；chilling temperature；cold resistance；gene

S184

A

1674-0874（2012）06-0052-04

2012-09-25

劉文英（1981-），女，山西大同人，博士，講師，研究方向：植物基因克隆。