周劍 ，戴新華 ，李紅梅 ，弓愛君

(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

血清中17α-羥孕酮的測定方法及其研究進(jìn)展*

周劍1，2，戴新華2，李紅梅2，弓愛君1

(1.北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京 100083； 2.中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所，北京 100013)

闡述了17α-羥孕酮的檢測在臨床診斷研究方面的重要意義，綜述了血清中17α-羥孕酮的檢測方法及其研究進(jìn)展。

血清17α-羥孕酮；免疫法；高效液相色譜法；同位素稀釋質(zhì)譜法

17α-羥孕酮（C21H30O3）是在合成糖皮質(zhì)激素和性類固醇過程中產(chǎn)生的一種C-21內(nèi)源性孕激素，可以在17α-羥化酶作用下由孕酮轉(zhuǎn)化，或者在3β-羥類固醇脫氫酶（3β-HSD）作用下由17α-羥孕烯醇酮轉(zhuǎn)化，主要產(chǎn)生于腎上腺皮質(zhì)，部分產(chǎn)生于性腺。血清中的17α-羥孕酮主要與性激素共同作用，促進(jìn)個(gè)體器官的發(fā)育。育齡女性正常值為：卵泡期0.1～0.8 ng／mL，黃體期 0.27～2.9 ng／mL，妊娠末3個(gè)月2～12 ng／mL ；男性正常值為 0.31～2.13 ng／mL［1，2］。

血清中17α-OHP的測量是診斷因21-羥化酶缺乏所引起的先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（CAH）的主要手段［3-5］。先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（CAH）代表常染色體隱性激素的紊亂，這種紊亂主要是由于人體內(nèi)不同酶的缺乏導(dǎo)致，這些酶的缺乏影響人體內(nèi)合成氫化可的松和甾體激素，增加了17α-羥孕酮和雄激素的分泌，而先天性腎上腺增生90%以上是因?yàn)?1-羥化酶的缺失［6］。21-羥化酶缺乏的先天性腎上腺皮質(zhì)增生患者血清中17α-羥孕酮濃度明顯升高，11-羥化酶缺乏時(shí)，17α-羥孕酮上升幅度較?。?，8］。約 6% 的成年多毛女性有不同程度的21-羥化酶缺乏，這一類遲發(fā)型缺乏癥病例中17α-羥孕酮濃度常超過卵泡期的高限0.9 ng／mL。17α-羥孕酮的測定也用于分析男性和女性的普通痤瘡、男性禿頂及一些不明原因的不育癥［9］。

1 血清中17α-羥孕酮的測定方法

關(guān)于血清中17α-羥孕酮的研究開始于20世紀(jì)50年代，開始只是關(guān)注其在人體內(nèi)的反應(yīng)和作用，對于血清中17α-羥孕酮檢測的廣泛研究始于20世紀(jì)六七十年代，開始時(shí)采用免疫的方法主要為超微分析系統(tǒng)（ultra micro analytic system）和超微的酶聯(lián)免疫法(ELISA)，在此基礎(chǔ)上又發(fā)展了放射免疫法（radioimmunoassay）和時(shí)間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoroimmunoassay），后來又開發(fā)了液相方法、氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法等。

1.1 放射免疫法(RIA)

大部分的分析方法都需要用有機(jī)溶劑萃取或者用柱色譜分離，然后用RIA分析，需要采用氘標(biāo)記的17α-羥孕酮或其它標(biāo)記激素作為示蹤標(biāo)記物。Jndsay. F. Hotman等開發(fā)了一個(gè)直接固相放射免疫法，不使用萃取和離心的步驟，只需添加兩種有機(jī)溶劑，該方法能在24 h內(nèi)分析1 200個(gè)樣品。新西蘭臨床生物化學(xué)中心的K. H. James Yeo等在1984年就發(fā)表了關(guān)于血清中17α-羥孕酮檢測的放射免疫方法，他們主要采用甲苯和正己烷的混合溶液進(jìn)行簡單萃取，然后以125I作為示蹤物，以兔血清為抗體直接進(jìn)行RIA分析，日間和日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于15%和小于10%，靈敏度能達(dá)到3 pg，分析回收率達(dá)到93.5%（RSD=1.6%，n=15）。分析用時(shí)約3 h，比以3H為示蹤物更加快速，而且實(shí)驗(yàn)成本大為降低［10］。大部分主要的甾類激素都能夠在唾液中呈現(xiàn)，研究表明其濃度與人體血清中的濃度存在一定的聯(lián)系，所以有時(shí)在血清樣品中難以取得時(shí)，唾液中激素的檢測也能起到積極的作用，但由于唾液中激素含量相對較低，這就要求特異性好和靈敏度更高的放射免疫分析法，比利時(shí)的J. Bourque等研究了人體唾液中孕激素（主要是孕酮）的檢測方法，他們將融化的唾液樣品與標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記激素和稀釋的抗體血清混合，渦旋，37℃培育30 min，然后4℃過夜，在冰浴中將激素按是否結(jié)合標(biāo)記分離，進(jìn)行RIA測定，該方法的日間和日內(nèi)不確定度均小于10%，回收率為90%～100%［11］。為了檢測更低濃度唾液和血清中的17α-羥孕酮，希臘佩特雷醫(yī)學(xué)院內(nèi)分泌科的Panagiotis. G. Mylonas等采用與J. Bourque等相同的抗體和孵化方法，增加了10倍樣品量和孵化時(shí)間以提高靈敏度，實(shí)驗(yàn)測定了64個(gè)健康志愿者的唾液和血清樣品，分成4個(gè)組別分離處理后直接進(jìn)行RIA測定，唾液中和血清中17α-OHP含量的關(guān)聯(lián)性r2在0.62～0.77之間，實(shí)驗(yàn)證明該方法能很好地檢測唾液和血清中的低濃度17α-羥孕酮［12］。

1.2 酶聯(lián)免疫法

在免疫分析法被大量應(yīng)用于激素分析的情況下，放射免疫法的諸多缺點(diǎn)如示蹤物儲藏時(shí)間短、廢物核輻射泄露、必須特殊的放射性裝置等也漸漸受到分析人員的詬病，在此基礎(chǔ)上引入了酶聯(lián)免疫法等非放射性免疫分析法。Walter Hubl等于1988年用辣根過氧化物酶作為酶標(biāo)記，開發(fā)了一個(gè)雙抗體／聚乙烯乙二醇固相酶聯(lián)免疫的方法，該方法使用涂有蛋白A和第二抗體的微量滴定管，大大節(jié)約成本，且方法有較好的重復(fù)性（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.0%～6.0%）和回收率（91%～97%）［13］。古巴免疫分析中心的 Ernesto Carlos Gonzále等人于2008年開發(fā)了一種快速、簡單的酶聯(lián)免疫方法，以17α-羥孕酮結(jié)合堿性磷酸酶與17α-羥孕酮結(jié)合血清競爭，采取兔抗體血清，分析濾紙上血點(diǎn)內(nèi)17α-羥孕酮，分析緩沖液中以達(dá)納錯(cuò)替代17α-羥孕酮甾體激素結(jié)合蛋白，整個(gè)分析時(shí)間為3 h，分析范圍是10～250 nmol／L，日間和日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差與17α-羥孕酮濃度有關(guān)分別為5.5%～8.2%和6.4%～9.1%，分析回收率達(dá)到98%～103%，該方法能夠很好地用于新生兒CAH檢測［14］。

1.3 時(shí)間分辨熒光免疫法

芬蘭臨床分析中心Ruben Rene Gonzalez等在RIA方法的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種快速、高通量的直接固相時(shí)間分辨熒光免疫法（TRFLA）檢測血清和干血濾紙斑點(diǎn)中的17α-羥孕酮，他們使用17α-OHP-3-carboxymethyloxime與聚賴氨酸（polylysine）結(jié)合作為標(biāo)記，使得每個(gè)17α-羥孕酮分子能夠結(jié)合34原子的銪，具有更高的放射性活度，這個(gè)分析基于標(biāo)記的17α-OHP3CMO和17α-羥孕酮在血液樣本中與多克隆兔17α-羥孕酮抗體的競爭，標(biāo)記的抗體混合物通過與兔抗體表面結(jié)合進(jìn)行分離，分析緩沖液包含達(dá)那唑來取代17α-羥孕酮與血清中蛋白的綁定。對于血清樣品，常溫下孵化完成需要1 h，而對于干血濾紙斑點(diǎn)需要在4℃放置過夜，同一分析物采取的兩種樣本測定結(jié)果有較好的一致性，該方法對血清和干血濾紙斑點(diǎn)中17α-羥孕酮最低檢測限分別為0.10 nmol／L和0.75 nmol／L，日內(nèi)和日間測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在 5%～15% 之間［15］。

1.4 液相色譜法

大多數(shù)免疫方法在進(jìn)行血清中的激素分析前，首先要對樣品進(jìn)行層析分離或者用其它方法純化，造成整個(gè)分析過程冗長、復(fù)雜，而且在前處理過程中容易造成待分析成分的丟失，由于交叉反應(yīng)難以保證分析的特異性，使得分析結(jié)果不準(zhǔn)確，分析不確定度增加。為了避免上述缺點(diǎn)，液相色譜被引用進(jìn)行唾液或血清中的激素分析。康涅狄格大學(xué)的Ernesto Canalls等較早開發(fā)了血清中17α-羥孕酮的高效液相色譜分析方法，該實(shí)驗(yàn)用二氯甲烷從1 mL血清中萃取待測物，萃取液用0.1 mol／L的氫氧化鈉溶液和水沖洗后在氮?dú)馍洗蹈?，然后用甲?水混合液復(fù)溶，樣品用μBondapak C18色譜柱分析，17α-羥孕酮檢出限達(dá)到 2.5 μg／L，加標(biāo)回收率達(dá)到95%～105%，分析結(jié)果的不確定度小于10%。該方法通過優(yōu)化液相流動相，使得血清中氫化可的松、11-羥基可的松和17α-羥孕酮的保留時(shí)間不同，從而同時(shí)檢測血清中多種激素含量，方法簡單、準(zhǔn)確且與RIA方法測定數(shù)據(jù)趨勢一致［16］。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜法

隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，由于其較高的靈敏度而被大量引入進(jìn)行血清中激素的分析研究，上海復(fù)旦大學(xué)的鄧春輝、張祥民等人使用N，O-雙(三甲基硅烷)三氟乙酰胺作為衍生試劑，以乙腈為溶劑，在微波照射下使得血清中17α-羥孕酮發(fā)生三甲基硅烷化反應(yīng)，微波功率700 W，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微波照射可以增加羰基結(jié)合含氧基團(tuán)，降低衍生反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)時(shí)間縮短為120 s，遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)的反應(yīng)時(shí)間45 min。衍生物進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）檢測，選用HP-5 MS柱（30 m×0.25 μm，0.25 mm），采用不分流模式，進(jìn)樣體積為1 μL，柱溫程序：初始溫度80℃，以15℃／min的速度升溫到300℃，保持10 min，采用選擇離子檢測模式（SIM）在EI源下檢測m／z359離子，四級桿、傳輸線和離子源溫度分別為150，280，230℃。該方法定性檢出限達(dá)到 1.0 ng／mL，方法重復(fù)性相對不確定度小于7.9%，方法回收率為102%［17］。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜法

文獻(xiàn)記載了很多氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法測定血清中17α-羥孕酮等甾體激素，這些方法都有很好的特異性，但是往往反應(yīng)通量很低，需要較大體積的血清原料，美國鹽湖城大學(xué)Mark. M. Kushnir等開發(fā)了一種靈敏、特異的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS／MS）同時(shí)分析4種血清中腎上腺甾體激素，該方法前處理使用樣品量為200 μL，加入一定量的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品通過固相微萃?。⊿PE），最后用甲基叔丁基醚（MTBE）洗脫，洗脫液在氮?dú)庀麓蹈珊?，加?00 μL pH 10的羥胺水溶液復(fù)溶衍生，渦旋而且在90℃孵化30 min，衍生后溶液用2 mL MTBE萃取，萃取溶液吹干后用流動相復(fù)溶進(jìn)行質(zhì)譜檢測。質(zhì)譜條件：ESI源，多重離子檢測模式（MRM），檢測離子對為361.2／124.1，361.2／112.1，該方法定量檢出限為0.05 μg／L，定性檢出限為0.025 μg／L，回收率達(dá)到 97.2%［18］。

上述方法雖然采用了LC-MS-MS提高了靈敏度和特異性，但是實(shí)驗(yàn)中采用了衍生的步驟，而衍生實(shí)驗(yàn)對于實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)要求較高，不利于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的普及，在此基礎(chǔ)上加拿大的Michele. L. Etter等開發(fā)了SPE萃取后直接進(jìn)行LC-MS-MS測定的方法，氘代17α-OHP 作為內(nèi)標(biāo)加入血清樣品中，混合均勻后進(jìn)行SPE萃取，用C16反相氨基色譜柱分離，分析時(shí)間為7 min，定量用ESI源正離子模式選擇離子監(jiān)控模式，17α-羥孕酮和氘代17α-羥孕酮離子對分別為：331／109和339／113。該方法日內(nèi)和日間不確定度分別為7.4%和10.0%，線性范圍為0.156～80 nmol／L，定量檢出限為 0.2 nmol／L［19］。

2 國內(nèi)外血清中17α-OHP臨床參考系統(tǒng)研究現(xiàn)狀及展望

目前，涉及臨床、大眾健康、生物技術(shù)等領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制是各國研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)［20］。歐盟（IRMM）僅肌酐有不同濃度的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如血清肌酐BCR573，BCR574以及BCR575；血清中雌二醇也有3種不同濃度的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BCR576，BCR577及BCR578；血清氫化可的松標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-DA192，ERM-DA193，ERM-DA451三種；血清中孕酮的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)BCR-348R，ERM-DA347等。美國NIST已經(jīng)研制了多種血清基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和激素類純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，例如膽固醇純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM911，SRM911a；尿素純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM912a；尿酸純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM913a；肌酐純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM914a；氫化可的松純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM921；冰凍血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（肌酸）967a；冰凍血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（氫化可的松、睪酮、孕酮）SRM971等。作為其工作的一部分，開發(fā)了新的快速液相-同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-LC／MS）來代替之前的氣相-同位素稀釋質(zhì)譜法（ID-GC／MS）。

澳大利亞針對奧運(yùn)食品中興奮劑檢測也研制了睪酮及其氘代物的純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，分別為NARL CRM M914和NARL CRM D546，已應(yīng)用于臨床檢驗(yàn)的量值溯源。日本臨床化學(xué)方面標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要有膽固醇純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NMIJ CRM 6001-a、肌酐純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)NMIJ CRM 6005-a。

國際臨床檢驗(yàn)高準(zhǔn)確度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也有很多不完善之處，有很多檢驗(yàn)項(xiàng)目，包括激素、傳染病血清學(xué)檢測標(biāo)志物等缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，只有一些標(biāo)準(zhǔn)方法而沒有相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)配合使用，如17α-羥孕酮、雌酮以及雌三醇等均無有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以供臨床檢驗(yàn)使用。

目前，中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所最新研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有冰凍人血清尿素成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 09157）、冰凍腎病人血清尿酸成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 09169）、冰凍人血清肌酐成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 09170，GBW 09171），及冰凍人血清葡萄糖、肌酐、尿酸、尿酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW 09174，GBW 09175，GBW 09176）。然而國內(nèi)針對純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)17α-羥孕酮、血清中的重要非肽激素類物質(zhì)如17α-羥孕酮的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究尚未見報(bào)道。中國計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)所應(yīng)國家科技部門的要求，正在進(jìn)行利用LC-IDMS方法針對純品17α-羥孕酮和血清中17α-羥孕酮基準(zhǔn)方法的研究，一些方法學(xué)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，該方法準(zhǔn)確可靠。目前正在對該方法進(jìn)行完善，以提高靈敏度、增加檢測通量、減少溶劑用量。

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Determination Method of 17α-OHP in Serum and Its Research Progress

Zhoujian1，2， Dai Xinhua2， Li Hongmei2， Gong Aijun1
(1. School of Chemical and Biological Engineering， University of Science and Technology Beijing， Beijing 100083， China；2. Chemical Metrology and Analytical Science Division， National Institute of Metrology， Beijing 100013， China)

The important of measure of 17α-OHP in the field of clinical diagnosis was illustrated.Determination methods for 17α-OHP and their research progress were systematically summarized.

erum 17α-OHP; immunization; HPLC; isotopic dilution MS

O652.2

A

1008–6145(2012)02–0096–03

10.3969／j.issn.1008–6145.2012.02.30

*國家科技基礎(chǔ)專項(xiàng)(2011FY130100)

聯(lián)系人： 周劍；E-mail： zhoujian_8382@yahoo.cn

2011-11-03