付紅運(yùn)，王銳英

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣西桂林541000）

雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)與純化的研究進(jìn)展

付紅運(yùn)，王銳英*

（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，廣西桂林541000）

雪旺細(xì)胞在周圍神經(jīng)損傷后在修復(fù)過程中所起的重要作用，使其成為在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞。在雪旺細(xì)胞提取過程中，由于其與成纖維細(xì)胞較難分離，導(dǎo)致雪旺細(xì)胞被成纖維細(xì)胞污染的概率較高，因此如何應(yīng)用有效的方法來提取雪旺細(xì)胞，盡可能的在短期內(nèi)獲得純度較高的雪旺細(xì)胞成為一研究熱點(diǎn)。目前對(duì)于雪旺細(xì)胞的提純及培養(yǎng)有多種方法，本文就目前國內(nèi)外新近雪旺細(xì)胞提純及培養(yǎng)的技術(shù)做一綜述，為雪旺細(xì)胞的提純及培養(yǎng)提供一定的借鑒。

雪旺細(xì)胞；體外培養(yǎng)；純化

雪旺細(xì)胞是周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的成髓鞘細(xì)胞，主要分布于周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的突起周圍，其能夠分泌多種神經(jīng)生長因子及促突起生長因子來營養(yǎng)、趨化神經(jīng)和促進(jìn)軸突的再生[1]。雪旺細(xì)胞由于其自身分泌功能在人工神經(jīng)中通常作為種子細(xì)胞，并且起到核心的作用。在周圍神經(jīng)損傷中，可出現(xiàn)雪旺細(xì)胞的增殖[2]，在人工神經(jīng)中雪旺細(xì)胞和嗅球成鞘細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用，可以使缺損神經(jīng)再生速度達(dá)到自體神經(jīng)移植同樣的效果[3]。

1 雪旺細(xì)胞的來源及取材

1.1 雪旺細(xì)胞的來源目前用于培養(yǎng)雪旺細(xì)胞的宿主主要來源于哺乳類動(dòng)物，包括大鼠、兔、靈長類動(dòng)物及人本身。Casella等[4]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：隨生物進(jìn)化程度增高，培養(yǎng)難度也就隨之增大。在動(dòng)物的胚胎及新生期，雪旺細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，并且隨著動(dòng)物年齡的增大，雪旺細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)變強(qiáng)，增殖能力也下降，所以用于研究的雪旺細(xì)胞多取材于胚胎、新生動(dòng)物[5]。

1.2 雪旺細(xì)胞的取材雪旺細(xì)胞主要的取材部位是坐骨神經(jīng)、腓腸神經(jīng)及背脊神經(jīng)。為提高雪旺細(xì)胞的含量，Kraus等[6]在提取雪旺細(xì)胞之前，提前坐骨神經(jīng)離斷，經(jīng)過1～2 W的瓦勒變性后，坐骨神經(jīng)中雪旺細(xì)胞的含量較未經(jīng)過瓦勒變性的坐骨神經(jīng)增加了50%。不同部位的取材各有優(yōu)缺點(diǎn)，坐骨神經(jīng)較背脊神經(jīng)容易獲取，但由于其神經(jīng)外膜完全剝離較困難，體外分離時(shí)耗時(shí)較長，影響了細(xì)胞的活性，而背根神經(jīng)節(jié)幾乎無神經(jīng)外膜，獲取雪旺細(xì)胞較為容易，取材于背根神經(jīng)節(jié)獲得的雪旺細(xì)胞的數(shù)量、純度及活性都優(yōu)于坐骨神經(jīng)[7]，取材于背根神經(jīng)節(jié)的雪旺細(xì)胞在以后的培養(yǎng)過程中增殖能力也優(yōu)于坐骨神經(jīng)[8]。此外，不同來源的雪旺細(xì)胞在培養(yǎng)過程中也表現(xiàn)出不同，來源于感覺性神經(jīng)的雪旺細(xì)胞其神經(jīng)生長因子的表達(dá)水平要優(yōu)于運(yùn)動(dòng)性神經(jīng)[9]。

2 雪旺細(xì)胞的培養(yǎng)純化方法

分離雪旺細(xì)胞的脊神經(jīng)、背根神經(jīng)節(jié)等都有外膜和內(nèi)膜的包被，內(nèi)膜及外膜中含有大量的成纖維細(xì)胞，其在體外培養(yǎng)過程中生長速度比雪旺細(xì)胞快，成為污染雪旺細(xì)胞的主要細(xì)胞類型。如不將其剔除干凈，在培養(yǎng)過程中難免會(huì)污染雪旺細(xì)胞。應(yīng)用顯微解剖鏡剝除外膜，也難免留下少量成纖維細(xì)胞，影響污染雪旺細(xì)胞純度，所以很多學(xué)者主張?jiān)诮馄始芭囵B(yǎng)的過程中盡可能的剔除及殺死成纖維細(xì)胞，提高雪旺細(xì)胞的濃度。

2.1 雙向差速法將制備好的雪旺細(xì)胞懸浮液接種于多聚賴氨酸鋪被的培養(yǎng)瓶中，靜置30 min，利用成纖維細(xì)胞沉降速度比雪旺細(xì)胞快、多聚賴氨酸對(duì)其吸附性高的特點(diǎn)，使大部分成纖維細(xì)胞貼壁。雪旺細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，此時(shí)懸浮液中含有的成纖維細(xì)胞將大大減少，放入新的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，除去上清液。利用兩者貼壁能力的差異，用0.05%的復(fù)合膠原酶消化30 min，將貼壁能力弱的雪旺細(xì)胞首先被消化下來，由于成纖維細(xì)胞的貼壁能力較強(qiáng)而被遺留，利用此法可進(jìn)一步去除成纖維細(xì)胞[10]。

2.2 差速分離法將制備好的雪旺細(xì)胞混懸液放入加有胎牛血清、毛喉素、調(diào)蛋白-β-1的α-MEM培養(yǎng)液(SCCM)中，將上述細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入涂有層粘連蛋白的燒瓶中培養(yǎng)。48 h后將培養(yǎng)液替換為被α-MEM稀釋過的復(fù)合膠原酶中，在37℃下孵育30 min，然后震蕩30～60 s，離心5 min后，棄上清液。將下層沉淀繼續(xù)放入SCCM中懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入同樣涂有層粘連蛋白的燒瓶中進(jìn)行第二輪的純化。利用復(fù)合膠原酶對(duì)兩者的消化能力的不同，第一輪純化后雪旺細(xì)胞的純度約68%，經(jīng)過第二輪的純化，雪旺細(xì)胞的純度可達(dá)到98%[11]。

2.3 層粘連蛋白吸附法利用層粘連蛋白與雪旺細(xì)胞親和力較強(qiáng)的特點(diǎn)[12]，把制備好的雪旺細(xì)胞懸液放入涂有層粘連蛋白的燒瓶中，使雪旺細(xì)胞被吸附入層粘連蛋白中，而成纖維細(xì)胞與層粘連蛋白親和力較差，則繼續(xù)留在混懸液中，30 min后將燒瓶中上清液棄掉，重新加入培養(yǎng)液，如此往復(fù)循環(huán)5次。隨著每次循環(huán)，雪旺細(xì)胞的純度也隨之增加，經(jīng)過第1次循環(huán)后雪旺細(xì)胞純度72%～75%，經(jīng)過5次循環(huán)，純度可高達(dá)90%[13]。

2.4 神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1純化法Rosenfeldt等[14]發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞在浮動(dòng)的膠原酶環(huán)境中減弱了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑，在此環(huán)境中成纖維細(xì)胞會(huì)發(fā)生退化而非增殖。基于此法，Isabel等[15]用加有10%胎牛血清、青霉素及重組人調(diào)節(jié)蛋白1的CGM培養(yǎng)基，在15%CO237℃條件下培養(yǎng)7 d。7 d后，用Hank's平衡鹽溶液沖洗，將其剪碎后在加有胰蛋白酶2型、膠原酶2型的CGM培養(yǎng)液中孵育，然后用1 ml吸管吹打，把混懸液離心3 min后用DMEM培養(yǎng)液將離心后的細(xì)胞懸液沖洗兩遍后繼續(xù)放入CGM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待基地細(xì)胞生長至融合交匯后用加有Ca2+、Mg2+的Hank's培養(yǎng)液沖洗三遍，經(jīng)免疫細(xì)胞學(xué)檢查后S100純度可達(dá)到83%。

2.5 MGM培養(yǎng)基抑制法用涂有層粘連蛋白的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)雪旺細(xì)胞混血液24 h，然后用加有毛猴素、成纖維細(xì)胞生長因子及牛腦垂體提取物的黑色素細(xì)胞培養(yǎng)基(MGM)替代DMEM培養(yǎng)基。待75%細(xì)胞相互融合后，用PBS緩沖液及鈣離子螯合劑沖洗，然后晃動(dòng)培養(yǎng)瓶2～4 min，隨后進(jìn)行離心10 min。應(yīng)用此法，經(jīng)免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)p75純度可達(dá)到99%[16]。

2.6 低濃度酶溶液培養(yǎng)法將制備好的雪旺細(xì)胞懸液放入加有盤尼西林及鏈霉素的10%FBS液中培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿后，將細(xì)胞移入涂有聚-L-賴氨酸的培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)液使用10%FBS，培養(yǎng)2 d后更換培養(yǎng)液以便移除殘余組織碎片及無活性的細(xì)胞。等待細(xì)胞長至相互融合后，用0.25%胰蛋白酶替代培養(yǎng)皿中上清液，使貼壁的細(xì)胞脫離瓶壁。消化完成后在混懸液中加入10 ml PBS再次離心，棄上清，用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后改用2.5%PBS液。連續(xù)培養(yǎng)10 d，雪旺細(xì)胞純度可達(dá)到97%[17]。

2.7 抗有絲分裂法將制備好的雪旺細(xì)胞混懸液用雪旺細(xì)胞純化培養(yǎng)液(加有10%FBS 10 μmol/L Ara-C 1%雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)液）消除成纖維細(xì)胞，24 h后用DMEM/F-12培養(yǎng)液沖洗去除細(xì)胞碎片，繼續(xù)用促雪旺細(xì)胞生長培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，48 h用PBS液和0.05%胰蛋白酶沖洗。把雪旺細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液以4：1加入終止酶反應(yīng)，800～1 000 r/min離心5 min，棄上清。將混懸液繼續(xù)放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)至細(xì)胞相互融合，然后用PBS液和2.5%胰蛋白酶沖洗兩次，用FBS終止酶反應(yīng)，繼續(xù)以800～1 000 r/min離心5 min，棄上清，混懸液繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過以上步驟，免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)S100純度可達(dá)99.4%[18]。

2.8 免疫磁珠法將制備好的細(xì)胞混懸液接種7 d后，加入0.25%胰蛋白酶，制備成細(xì)胞懸液，然后加入Mouse Anti-p75LNGFr，37℃培養(yǎng)10 min后，加入免疫磁珠。再于37℃條件下培養(yǎng)15 min，置于磁性離心器上，吸去上清后加入含20%胎牛血清的DF12培養(yǎng)液，在5%CO237℃培養(yǎng)24 h，再次置于磁性離心器，取上清移至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)2 d后即可進(jìn)行傳達(dá)培養(yǎng)。經(jīng)過此法培養(yǎng)2 d后，雪旺細(xì)胞活力約96%，純度約為98%[19]。

3 影響雪旺細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖的因素

雪旺細(xì)胞在體外培養(yǎng)的環(huán)境不同于體內(nèi)，沒有體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，在培養(yǎng)過程中容易受外界因素的影響，培養(yǎng)基中某一物質(zhì)濃度的高、低及加入某一物質(zhì)都會(huì)影響雪旺細(xì)胞的增殖與否。

3.1 胎牛血清對(duì)雪旺細(xì)胞的影響血清在細(xì)胞培養(yǎng)中不僅提供細(xì)胞生長的必需成分，而且為細(xì)胞在培養(yǎng)基中貼壁、鋪被提供所需因子。Komiyama等[20]已經(jīng)證實(shí)，不同濃度的胎牛血清對(duì)雪旺細(xì)胞的增殖影響也不同。分別用0%～10%胎牛血清培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，當(dāng)胎牛血清濃度為10%時(shí)，不僅可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的快速增殖，同時(shí)也可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖；無血清培養(yǎng)時(shí)，雪旺細(xì)胞從離體坐骨神經(jīng)遷出較含血清培養(yǎng)時(shí)更為明顯；胎牛血清濃度為2.5%時(shí)，促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖及抑制成纖維細(xì)胞的比值達(dá)到最高，為雪旺細(xì)胞純化的最佳濃度。

3.2 基底膜濃度對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的影響武雷等[21]通過用不同濃度的基底成分培養(yǎng)雪旺細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，不同濃度的基底對(duì)雪旺細(xì)胞的增殖影響不同。當(dāng)層粘連蛋白、纖維粘連蛋白和Ⅳ型膠原濃度分別為500 μg/ml、300 μg/ml、100 μg/ml時(shí)可發(fā)揮最大促增殖效應(yīng)，并且隨濃度的減低其促增殖效應(yīng)減弱。

3.3 消化酶對(duì)雪旺細(xì)胞的影響李春雨等[22]分別用胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶及兩者混合酶消化乳鼠坐骨神經(jīng)，并將獲取的雪旺細(xì)胞傳代培養(yǎng)，24 h后計(jì)數(shù)雪旺細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者混合酶可較早出現(xiàn)雪旺細(xì)胞的增殖高峰，胰蛋白酶組出現(xiàn)最晚，并且兩者分別對(duì)雪旺細(xì)胞有一定程度的損傷，當(dāng)兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)可達(dá)到最佳消化效果。

3.4 高糖對(duì)雪旺細(xì)胞的影響目前關(guān)于高糖對(duì)雪旺細(xì)胞培養(yǎng)的增殖與否尚存爭(zhēng)議，現(xiàn)有的文獻(xiàn)對(duì)此有不同的結(jié)論。1998年Kuruvilla等[23]通過實(shí)驗(yàn)得出高糖對(duì)腫瘤源性雪旺細(xì)胞有增殖作用的結(jié)論。2003年Kamiya等[24]分別用高糖及低糖培養(yǎng)鼠雪旺細(xì)胞，結(jié)果高糖組與低糖組相比雪旺細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，此結(jié)論與2006年Wu等[25]對(duì)取源于新生大鼠坐骨神經(jīng)雪旺細(xì)胞用高糖及低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果一致。在上述文獻(xiàn)中，Kuruvilla等[23]與Kamiya等[24]及Wu等[25]所用雪旺細(xì)胞的來源不同，這有可能是導(dǎo)致高糖引起雪旺細(xì)胞的增殖與否結(jié)論不一致的原因。高糖對(duì)雪旺細(xì)胞的影響尚需進(jìn)一步證實(shí)。

3.5 吡咯喹啉醌對(duì)雪旺細(xì)胞的影響吡咯喹啉醌是一種葡萄糖脫氫酶輔基，能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。為觀察吡咯喹啉醌對(duì)雪旺細(xì)胞增殖及生長因子分泌的影響，賀斌等[26-27]在雪旺細(xì)胞培養(yǎng)基中加入吡咯喹啉醌發(fā)現(xiàn)，加入吡咯喹啉醌后雪旺細(xì)胞的形態(tài)由明顯的尖對(duì)尖、并排的束狀生長方式變?yōu)榧?xì)胞數(shù)較少處為束狀排列、細(xì)胞數(shù)較多處為簇狀排列或圈狀。當(dāng)吡咯喹啉醌濃度在1～10 000 nmol/L之間時(shí)，可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖，同時(shí)使細(xì)胞的EGR1、EGR2及Sox10基因表達(dá)增高，濃度為100 nmol/L時(shí)促進(jìn)表達(dá)能力最強(qiáng)，濃度大于10 000 nmol/L時(shí)對(duì)上述基因表達(dá)表現(xiàn)為抑制作用。

3.6 甲基潑尼松龍對(duì)雪旺細(xì)胞的影響蔡鴻敏等[28]于2008年為了研究甲基潑尼松龍對(duì)雪旺細(xì)胞增殖的影響，分別用0.1 mg/L、1.0 mg/L濃度的甲基潑尼松龍培養(yǎng)預(yù)變性7 d的兔坐骨神經(jīng)組織塊，并且用含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，于傳代培養(yǎng)后在相差顯微鏡下觀察雪旺細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果兩組甲基潑尼松龍雪旺細(xì)胞增殖指數(shù)均較空白對(duì)照組高。同時(shí)使用流式細(xì)胞儀觀察到處于S期的雪旺細(xì)胞甲基潑尼松龍組也較空白對(duì)照組百分比高，但兩組不同濃度的甲基潑尼松龍之間無明顯差別。

3.7 免疫抑制劑對(duì)雪旺細(xì)胞的影響Fansal等[29]在2000年用免疫抑制劑FK506培養(yǎng)雪旺細(xì)胞來觀察其對(duì)雪旺細(xì)胞的影響，F(xiàn)ansa把FK506以每天100 μmol/L的劑量加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，并且設(shè)立空白對(duì)照，連續(xù)培養(yǎng)7 d，同時(shí)應(yīng)用激光掃描顯微鏡觀察其中的變化，結(jié)果免疫抑制劑組與空白對(duì)照組相比雪旺細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，并且在第2天時(shí)雪旺細(xì)胞增殖后的數(shù)量是起初的一倍。FK506在促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的同時(shí)也抑制了成纖維細(xì)胞的增長，這種現(xiàn)象在第4天時(shí)尤為明顯。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)加有FK506的雪旺細(xì)胞胞內(nèi)會(huì)出現(xiàn)一過性的Ca2+濃度升高，60 min后則會(huì)回到基礎(chǔ)水平。根據(jù)Steiner等[30]增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的理論，F(xiàn)K506則是通過增加胞內(nèi)Ca2+來促進(jìn)雪旺細(xì)胞的增殖。張振偉等[31]于2005年應(yīng)用免疫抑制劑FK506培養(yǎng)雪旺細(xì)胞，也證實(shí)了Fansa FK506能夠促進(jìn)雪旺細(xì)胞增殖的結(jié)論。

4 結(jié)語

隨著雪旺細(xì)胞培養(yǎng)方法的改進(jìn)，雪旺細(xì)胞的純度及數(shù)量較之前方法有了明顯提高，但有些方法周期較長、費(fèi)用較高。如何能設(shè)計(jì)出既簡(jiǎn)單又耗時(shí)短的方法，尚需進(jìn)一步探索。

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Progress on the in vitro culture and purification of Schwann cells.

FU Hong-yun,WANG Rui-ying.Department of Orthopaedics,Guilin Medical University,Guilin 541000,Guangxi,CHINA

Schwann cells plays an important role in the peripheral nerve damage repair,which makes it become the most widely used cells in the field of neuroscience research.It is difficult to separate Schwann cells from fibroblasts in the extraction process,which causes high probability of Schwann cells being polluted by fibroblasts.So how to separate and obtain high pure Schwann cells is the researching focus.Now there are numerous methods of Schwann cells purification and culture.This paper just makes a summary on the recent technology of Schwann cells purification and culture from the domestic and foreign documents to provide certain reference for the purification and culture of Schwann cells.

Schwann cells;Culture in vitro;Purification

R329.2+1

A

1003—6350（2012）22—118—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.22.050

2012-04-22)

付紅運(yùn)（1987—），男，山東省濟(jì)寧市人，在讀碩士。E-mail：benqiang333@163.com

*通訊作者：王銳英，博士，副教授，研究生導(dǎo)師。E-mail:benqiang333@163.com