申可佳，尤昭玲

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

體外受精－胚胎移植（in vitro fertilization embryo transfer, IVF-ET）及其衍生技術(shù)是人類輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology, ART）的主體，是臨床治療不孕不育癥的有效手段。決定IVF-ET成功率的主要因素是胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜容受性。胚胎質(zhì)量取決于優(yōu)質(zhì)的卵子和精子，而IVF- ET中卵子的獲得常需使用控制性超排卵（controlled ovarian hyperstimulation, COH）方案。COH是指以藥物的手段在可控制的范圍內(nèi)誘發(fā)多卵泡的發(fā)育和成熟，以便獲得更多可供移植的胚胎從而提高受孕率。COH應(yīng)用于IVF-ET 20余年，給眾多不育家庭帶來了福音，是IVF的關(guān)鍵技術(shù)之一。但在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，COH周期在促多卵泡發(fā)育的同時(shí)并非總能獲得理想數(shù)量的高質(zhì)量卵子及胚胎，這是影響IVF-ET臨床妊娠率的重要原因[1-3]。導(dǎo)師尤昭玲教授臨床診治不孕癥時(shí)陸續(xù)接診IVF-ET相關(guān)病例近萬余人次，根據(jù)患者在不同治療階段的不同證型，結(jié)合IVFET的相關(guān)影響因素，中西醫(yī)匯通，慎思明辨，法古創(chuàng)新，創(chuàng)立了一系列方藥及耳穴貼壓和藥膳飲食療法，在中、西醫(yī)婦科學(xué)術(shù)界產(chǎn)生了較大的影響[4-7]。在導(dǎo)師多年的理論和臨床經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)下，通過分析COH周期對(duì)卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量的可能影響，在前人相關(guān)的研究基礎(chǔ)上，本文以導(dǎo)師經(jīng)驗(yàn)方為切入點(diǎn)，思考如何深化研究中醫(yī)藥改善超排卵周期卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量的作用機(jī)制。

1 COH周期卵泡發(fā)育的特點(diǎn)與若干問題

生理狀態(tài)下，女性進(jìn)入青春期后，在促性腺激素和其它因素的刺激下，每個(gè)性周期有若干個(gè)始基卵泡開始生長(zhǎng)發(fā)育，但其中只有1～2個(gè)卵泡被選擇、優(yōu)勢(shì)化最終發(fā)育為成熟卵泡并排出卵子，其余的卵泡則在發(fā)育的不同階段通過細(xì)胞凋亡機(jī)制自行退化閉鎖。而超排卵周期同時(shí)誘發(fā)多個(gè)卵泡的發(fā)育和成熟，期望在同一時(shí)間點(diǎn)獲得多個(gè)高質(zhì)量卵子及可供移植的胚胎，這種打破生理常規(guī)的操作依賴于大劑量外源性激素的使用。這些藥物在促排卵的同時(shí)也帶來一系列副作用和并發(fā)癥，其中對(duì)卵泡發(fā)育的影響更是輔助生殖領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

對(duì)于人類和哺乳動(dòng)物的相關(guān)研究指出[8-16]，輔助生殖技術(shù)（ART）子代出生缺陷、低體質(zhì)量?jī)骸⒅卮蠡蔚娘L(fēng)險(xiǎn)較自然妊娠增加，從長(zhǎng)期安全性觀點(diǎn)來看，超排卵治療期間各種藥物對(duì)卵子的影響應(yīng)該引起人們重視。促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa）和促性腺激素（Gn，即FSH、LH）的使用對(duì)卵母細(xì)胞的發(fā)育起著重要而又復(fù)雜的作用。高劑量Gn對(duì)卵母細(xì)胞正常的減數(shù)分裂、表觀遺傳修飾和發(fā)育能力均有不同程度的影響：可增加小鼠卵母細(xì)胞紡錘體的缺陷或改變細(xì)胞內(nèi)某些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而增加染色體異常的可能性；可促使某些具有遺傳或發(fā)育缺陷的卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育成熟，或使一些沒有完全成熟的卵母細(xì)胞提前發(fā)生減數(shù)分裂；可導(dǎo)致卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞連接松散，卵母細(xì)胞皮質(zhì)顆粒過早出現(xiàn)；以及超排卵小鼠種植前和種植后胚胎死亡率均增高、胎鼠發(fā)育遲延；超排卵和自然周期小鼠胚胎基因組甲基模式有顯著不同，等等。在臨床工作中，超排卵周期被募集的多個(gè)卵母細(xì)胞，發(fā)育不同步、胞漿成熟難以評(píng)價(jià)，是全世界ART的一個(gè)共同難題。

卵巢內(nèi)部的細(xì)胞及分子構(gòu)成的局部環(huán)境是卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟的直接且重要的調(diào)控因素。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[17-23]，與自然周期相比，COH周期卵泡液中有蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，這些蛋白質(zhì)參與卵泡發(fā)育及排卵、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、類脂/類固醇代謝等過程，其中包括很多卵巢相關(guān)的細(xì)胞因子及其受體，如瘦素、激活素、血管內(nèi)皮因子等，它們的異常表達(dá)為進(jìn)一步探索COH對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟的影響提供了重要的線索。還有研究指出[24-25]，超排卵周期能引發(fā)較高程度的顆粒細(xì)胞凋亡，這可能是影響卵子質(zhì)量和數(shù)量的重要原因之一。以及超排卵過程中不同的個(gè)體卵巢對(duì)外源性促性腺激素有著不同的反應(yīng)，這直接影響到卵泡發(fā)育的多少，并最終影響IVF的累計(jì)妊娠率。若個(gè)體卵巢反應(yīng)低下，無論怎樣增加COH藥物劑量也無法獲得數(shù)量滿意的有效卵子。這種卵巢的低反應(yīng)性是當(dāng)今輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)難題，發(fā)生率約9%～24%，至今在西醫(yī)領(lǐng)域無很好的解決方法[26-28]。

2 中醫(yī)藥改善COH周期卵泡發(fā)育的研究思路

用傳統(tǒng)的中醫(yī)理論來看現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的超排卵方案，其試圖通過藥物在一個(gè)時(shí)間段促使多個(gè)卵泡共同發(fā)育并在同一時(shí)間點(diǎn)成熟，這會(huì)造成人體腎精、肝血的相對(duì)不足，腎精不足化卵，單個(gè)卵細(xì)胞得到的精血量少；沖任二脈缺乏腎陰和肝血的充養(yǎng)，無法使多個(gè)卵子同步健康地發(fā)育成熟。加之患者就診期間緊張的心理情緒，以及超排卵用藥影響機(jī)體的內(nèi)環(huán)境等，導(dǎo)致肝氣疏泄失調(diào)，氣機(jī)不利，沖任失暢，從而造成生卵、育卵、排卵障礙。若先天稟賦不足，或早婚，或房室不節(jié)，或驚恐傷志，或邪氣損傷，造成腎的功能失常，致使腎陰陽失衡，生精化氣生血功能不足，天癸的產(chǎn)生與分泌失調(diào)，沖任失固失養(yǎng)，則種子成孕的功能發(fā)生異常，這種情況似與COH周期的卵巢低反應(yīng)性同屬。

現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)是近20年發(fā)展起來的新技術(shù)，據(jù)文獻(xiàn)記載[29-41]，近10年來通過將中醫(yī)補(bǔ)腎調(diào)沖的原理合理應(yīng)用于ART，能促進(jìn)卵泡發(fā)育及改善卵子質(zhì)量、提高卵巢反應(yīng)性、減少促排卵藥物用量、改善子宮內(nèi)膜容受性，進(jìn)而提高妊娠率，且發(fā)現(xiàn)多種作用機(jī)制可能參與其中，如調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌功能、調(diào)節(jié)卵巢局部因子的表達(dá)等。但目前關(guān)于中藥輔治ART的研究存在的不足之處為：（1）研究主要集中在對(duì)中藥作用效果的描述，對(duì)作用機(jī)制的研究較少及不夠深入；（2）臨床辨證分型復(fù)雜，所用方藥多樣，重復(fù)性及對(duì)比性相對(duì)較差；（3）對(duì)同一方藥作用機(jī)制的研究不夠系統(tǒng)和深入；（4）劑型不統(tǒng)一，水煎湯劑難以在臨床推廣應(yīng)用。

尤昭玲教授從事中醫(yī)和中西醫(yī)結(jié)合婦科臨床、教學(xué)及科研工作近40年，在婦科疑難病癥-不孕不育的治療上有獨(dú)特的理論認(rèn)識(shí)和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。尤教授在長(zhǎng)期臨床接診IVF-ET相關(guān)失敗病例的過程中，分析思考IVF-ET失敗的可能原因，探索中醫(yī)輔助治療的切入思路、環(huán)節(jié)和方法，并在臨床實(shí)踐中逐漸完善、總結(jié)，形成了中醫(yī)輔治的理念、目的和相對(duì)穩(wěn)定的治療思路與方案。護(hù)卵湯是尤教授治療排卵障礙性不孕患者的經(jīng)驗(yàn)方，將其用于IVF-ET的輔助治療，能有效改善IVF-ET的成功率，且其為顆粒劑，患者服用方便，故在臨床運(yùn)用中得到了很好的推廣。護(hù)卵湯全方由熟地黃、生地、沙參、石斛、山藥、蓮肉、桑葚子、覆盆子、菟絲子、月季花、蓮子心、肉蓯蓉、甘草組成。該方旨在益腎健脾，暖巢增液，助養(yǎng)泡膜，宣通脈絡(luò)，促泡速長(zhǎng)，順勢(shì)而出；滋補(bǔ)腎精，助膜長(zhǎng)養(yǎng)。利用護(hù)卵湯研究中醫(yī)藥改善COH周期卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量的作用機(jī)制，可從以下幾個(gè)方面去探討：

（1）眾所周知，下丘腦－垂體－卵巢軸的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控與卵泡的發(fā)育及卵子的質(zhì)量密切相關(guān)，中藥護(hù)卵湯是否通過影響COH周期機(jī)體的內(nèi)分泌環(huán)境從而改善卵子質(zhì)量。

（2）卵巢顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞（尤其是顆粒細(xì)胞）是輔助卵母細(xì)胞成熟及排卵的重要且必要的細(xì)胞環(huán)境，卵巢顆粒細(xì)胞、卵泡膜細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞等體細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間存在廣泛的相互調(diào)節(jié)，卵巢體細(xì)胞的生長(zhǎng)凋亡對(duì)于卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞的質(zhì)量有著舉足輕重的作用。COH周期卵巢顆粒細(xì)胞凋亡較自然周期增多，研究護(hù)卵湯對(duì)COH周期卵巢體細(xì)胞凋亡的影響，能有效闡述其影響卵子質(zhì)量的作用機(jī)制。

（3）卵巢內(nèi)部蛋白構(gòu)成的卵巢微環(huán)境是影響卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞質(zhì)量的直接且重要環(huán)境。與自然周期相比，已發(fā)現(xiàn)COH周期卵巢微環(huán)境中部分細(xì)胞因子及其受體含量變化，進(jìn)而影響卵子質(zhì)量。護(hù)卵湯能否改變相關(guān)因子的表達(dá)從而改善卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量？在IVF-ET的相關(guān)文獻(xiàn)中，報(bào)道過中醫(yī)藥影響卵巢相關(guān)因子的表達(dá)，但這些研究要么著眼于基因水平，要么多以單個(gè)或幾個(gè)蛋白為研究對(duì)象。我們知道，生物功能的實(shí)際實(shí)施者是蛋白質(zhì)，且卵巢微環(huán)境涉及的蛋白分子眾多，卵泡發(fā)育/卵母細(xì)胞的成熟過程涉及到多種特異的生化、細(xì)胞和分子事件，因此僅憑對(duì)單個(gè)或幾個(gè)蛋白的研究還遠(yuǎn)不能揭示中醫(yī)藥對(duì)其影響的作用機(jī)制。近年來興起的蛋白質(zhì)組學(xué)研究是對(duì)特定細(xì)胞、組織或器官所包含的蛋白質(zhì)的系統(tǒng)研究，是從細(xì)胞及整體水平上研究蛋白質(zhì)的組成及其變化規(guī)律。研究的視野不再局限于一兩個(gè)蛋白質(zhì)的功能，而是擴(kuò)展到了成千上萬個(gè)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)。選用蛋白組學(xué)相關(guān)技術(shù)對(duì)護(hù)卵湯進(jìn)行研究，能系統(tǒng)全面地揭示中藥對(duì)COH周期卵巢微環(huán)境的影響。

（4）無論是下丘腦－垂體－卵巢軸分泌的激素，還是卵巢微環(huán)境中的蛋白分子，最終均通過細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)卵泡發(fā)育的調(diào)控。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是非常復(fù)雜的過程，涉及胞外配體、跨膜受體、胞內(nèi)各種信使分子，以及相關(guān)靶基因和最終調(diào)控的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，且多條通路與卵泡發(fā)育及卵母細(xì)胞成熟有關(guān)。選取相關(guān)的通路，研究護(hù)卵湯對(duì)COH周期卵巢細(xì)胞多靶點(diǎn)的影響，最能直觀地揭示中藥的作用機(jī)制。這方面的研究目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道。

綜上所述，在關(guān)于如何深化研究中醫(yī)藥改善COH周期卵泡發(fā)育及卵子質(zhì)量的思考中，筆者認(rèn)為應(yīng)從提高臨床治療效果、劑型改革、制定統(tǒng)一的療效觀測(cè)指標(biāo)等方面著手，將中醫(yī)藥輔助ART的研究深入到分子水平，系統(tǒng)全面地揭示其微觀機(jī)制，用更多科學(xué)的數(shù)據(jù)證實(shí)中醫(yī)藥在IVF-ET中的應(yīng)用價(jià)值。

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