徐曉武，楊小敏，金洲祥，許 遠(yuǎn)，朱少俊

華蟾素誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞凋亡與Bax/Bcl-2的關(guān)系

徐曉武1，楊小敏2，金洲祥1，許 遠(yuǎn)1，朱少俊1

目的：觀察華蟾素在誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株凋亡的過(guò)程中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的變化及意義。方法：在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中分別加入不同終濃度的華蟾素，24 h、48 h及72 h后檢測(cè)指標(biāo)。應(yīng)用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blot法檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)，共聚焦顯微鏡觀察Bax蛋白分布。結(jié)果：華蟾素能顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖；倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)凋亡的MCF-7細(xì)胞固縮、核染色質(zhì)凝聚；western blot發(fā)現(xiàn)華蟾素能上調(diào)MCF-7細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)，但對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)影響，正常MCF-7細(xì)胞內(nèi)的Bax均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，華蟾素處理后，Bax明顯地聚集于線粒體，呈現(xiàn)線粒體的轉(zhuǎn)位。結(jié)論：華蟾素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡，并在該過(guò)程中導(dǎo)致的Bax蛋白表達(dá)上調(diào)并且向線粒體轉(zhuǎn)位。

華蟾素注射液；人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7；凋亡；Bax；Bcl-2

中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是重要的抗腫瘤機(jī)制之一。華蟾素注射液是我國(guó)傳統(tǒng)藥材中華大蟾蜍陰干全皮加工制成的水溶性注射劑，主要成分是蟾毒靈及吲哚生物堿等，具有清熱解毒、利水消腫、化瘀潰堅(jiān)等作用[1]。本研究觀察了華蟾素對(duì)體外培養(yǎng)的MCF-7細(xì)胞凋亡與Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)的關(guān)系，并探討了華蟾素抗腫瘤的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料 華蟾素注射液（安徽金蟾生化股份有限公司，每支5 mL，批號(hào)041003）。兔抗Bax單克隆抗體、兔抗Bcl-2單克隆抗體、兔抗β-actin單克隆抗體、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（北京中杉金橋生物工程有限公司）。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株（上海微晶生物技術(shù)有限公司）。DMEM（GIBCO公司,美國(guó)）。MTT（Sigma公司）。FITC標(biāo)記Bax抗體。（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。TUNEL檢測(cè)試劑盒（上海生研生物技術(shù)公司）。高速冷凍離心機(jī)MR23i (法國(guó)Jouan)。熒光顯微鏡（Olympus,日本）。Leica TCS-SP2激光共聚焦掃描顯微鏡（LSCM，德國(guó)Leica公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。在培養(yǎng)中，細(xì)胞被置于37℃、5%CO2、飽和濕度下的培養(yǎng)箱內(nèi)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，行細(xì)胞計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1× 105個(gè)/mL。

1.3 檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 采用噻唑藍(lán)還原法（MTT比色法）。將細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于96孔板，每孔100 μL。24 h后加入華蟾素（終濃度分別為10、20及40 μg/mL），每個(gè)濃度重復(fù)5孔，獨(dú)立重復(fù)6次。以不加藥組為空白對(duì)照，在37℃、5% CO2的條件下培養(yǎng)孵育24 h、48 h及72 h，棄藥液。每孔加入5 mg/mL的MTT 10 μL，于完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 h。每孔加入20%SDS 100 μL，在37℃下放置20 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm波長(zhǎng)的光密度（OD）值。腫瘤細(xì)胞增殖抑制率（%）=[(對(duì)照組OD值-用藥組OD值)/對(duì)照組OD值]×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用40 μg/mL華蟾素作用細(xì)胞24 h、48 h及72 h，收集細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察、拍攝細(xì)胞形態(tài)變化。

1.5 檢測(cè)Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) 胰酶消化并收集經(jīng)40 μg/mL華蟾素作用24 h、48 h及72 h的MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白20 μg加樣，經(jīng)15%SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。含5%脫脂奶粉PBS溶液封閉，4℃孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫1 h，棄去牛奶，孵育1抗3 h，PBS洗膜3次，每次15 min。孵育2抗1.5 h，PBS洗膜3次，每次15 min。熒光試劑盒顯影曝光。采用Quantity One軟件進(jìn)行圖像灰度分析，計(jì)算Bax和Bcl-2與β-actin的灰度比值，以表示Bax和Bcl-2的相對(duì)表達(dá)量，不加華蟾素組做對(duì)照。

1.6 檢測(cè)細(xì)胞凋亡 胰酶消化并收集細(xì)胞，采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法，按TUNEL檢測(cè)試劑盒推薦步驟操作，熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞漿出現(xiàn)黃綠色熒光信號(hào)確定為凋亡細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptotic index,AI＝染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞數(shù)×100%）。

1.7 檢測(cè)Bax蛋白 收集經(jīng)40 μg/mL華蟾素作用72 h的MCF-7細(xì)胞，加入適當(dāng)濃度的線粒體熒光染料Mito Tracker Red，于37℃孵育25 min，冷PBS清洗，在40 g/L多聚甲醛中室溫固定15 min，并用2 mL/L Triton X-100透化處理5 min。以PBS充分清洗，加100 mL/L羊血清封閉1 h，依次加入兔抗Bax抗體（4℃孵育過(guò)夜，PBS充分清洗）及FITC標(biāo)記的抗兔IgG（避光孵育30 min），激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

2結(jié)果

2.1 華詹素對(duì)細(xì)胞增殖抑制的影響 各濃度華蟾素均能顯著抑制細(xì)胞增殖，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)抑制率隨藥物濃度增加呈上升，40 μg/mL的華蟾素作用72 h引起的生長(zhǎng)抑制率達(dá)56.31%。部分組間呈現(xiàn)時(shí)-效和量-效依賴(lài)關(guān)系（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常的MCF-7細(xì)胞成團(tuán)大量生長(zhǎng)，細(xì)胞圓潤(rùn)飽滿(mǎn)，細(xì)胞形態(tài)良好。40 μg/mL華蟾素處理后，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞固縮變形，體積變小。見(jiàn)圖1。

表1 不同濃度華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用(±s，n=15)

表1 不同濃度華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用(±s，n=15)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與10 μg/mL組比較，bP＜0.05；與20 μg/mL組比較，cP＜0.05；與24 h組比較，dP＜0.05

濃度(μg/mL)對(duì)照組（0）10 20 40增殖抑制率（%）24 h 0 13.62±2.82 18.47±3.55 24.27±3.55a48 h 0 17.52±2.53 29.16±3.62a40.83±3.57a、b、c 72 h 0 24.25±2.89a41.67±4.37a、b、d 56.31±4.81a、b、c、d

圖1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)（×200）

2.3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 與對(duì)照組相比，華蟾素處理組綠色熒光的凋亡細(xì)胞核增高，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸增加。見(jiàn)圖2。不同濃度組之間比較，增殖抑制率差異有顯著性，部分組間呈現(xiàn)時(shí)-效和量-效依賴(lài)關(guān)系（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖2MCF-7細(xì)胞TUNEL染色法（×200）

2.4 western blot檢測(cè)Bax/Bcl-2蛋白表達(dá) Western blotting結(jié)果經(jīng)灰度值分析后顯示，隨著華蟾素作用時(shí)間的延長(zhǎng)，MCF-7細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)逐漸上調(diào)，呈現(xiàn)時(shí)-效依賴(lài)關(guān)系（P＜0.05），而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、表3。

表2 不同濃度華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=15)

表2 不同濃度華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響(±s，n=15)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與10 μg/mL組比較，bP＜0.05；與20 μg/mL組比較，cP＜0.05；與24 h組比較，dP＜0.05

濃度(μg/mL)對(duì)照組10 20 40細(xì)胞凋亡率（%）24 h 10.24±1.61 11.35±2.33 12.24±3.15 16.37±2.18a48 h 10.24±1.61 13.52±2.29 18.16±3.52a30.73±3.46a、b、c、d 72 h 10.24±1.61 16.25±2.53 26.67±4.71a、b 51.42±4.27a、b、c、d

圖3 40 μg/mL華詹素對(duì)MCF-7細(xì)胞表達(dá)Bcl-2和Bax蛋白的影響

表3 40 μg/mL華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響(±s，n=15)

表3 40 μg/mL華蟾素對(duì)MCF-7細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響(±s，n=15)

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05；與24 h組比較，bP＜0.05；與48 h組比較，cP＜0.05

Time(h)對(duì)照組24 48 72 Bcl-2 0.43±0.022 0.42±0.021 0.40±0.019 0.37±0.016 Bax 0.47±0.025 0.51±0.029 0.62±0.033a0.75±0.036a、b、c

2.5 Bax蛋白細(xì)胞熒光免疫檢測(cè) 正常MCF-7細(xì)胞內(nèi)的Bax均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，華蟾素處理后，Bax明顯聚集于線粒體上，呈現(xiàn)明顯的線粒體的轉(zhuǎn)位。見(jiàn)圖4。

圖4 40 μg/mL華詹素處理MCF-7細(xì)胞72 h后Bax蛋白線粒體轉(zhuǎn)位

3 討論

腫瘤的發(fā)生與增殖、凋亡與分化三者的平衡失調(diào)而導(dǎo)致的細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)增殖和凋亡受阻有關(guān)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物,將在腫瘤的治療中發(fā)揮重要作用。本研究采用MTT法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)華蟾素能抑制MCF-7細(xì)胞增殖，且呈明顯的量—效與時(shí)—效關(guān)系。利用倒置顯微鏡觀察MCF-7細(xì)胞與華蟾素作用后的形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)凋亡的MCF-7細(xì)胞固縮、核染色質(zhì)凝聚，這種變化隨著華蟾素濃度的上升和作用時(shí)間的延長(zhǎng)而變得顯著。

凋亡是細(xì)胞在基因調(diào)控下的主動(dòng)死亡形式，調(diào)控凋亡的基因可分為凋亡促進(jìn)基因和凋亡抑制基因兩類(lèi)。Bcl-2基因?qū)儆贐cl-2家族基因，是最重要的抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的基因，與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。Bax是Bcl-2家族中重要的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，其編碼蛋白氨基酸序列有21%與Bcl-2同源，Bax可與Bcl-2形成同源或異源二聚體，具有抑制Bcl-2，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax兩者之間的比例決定了細(xì)胞的命運(yùn)，若Bax占多數(shù)，則Bcl-2被抑制，凋亡被誘導(dǎo)，細(xì)胞死亡；反之則Bax受到抑制，細(xì)胞得以生存[2]。Bax不但拮抗Bcl-2抑制凋亡的作用[3-4]，而且能夠直接促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Western blotting結(jié)果經(jīng)灰度值分析后顯示，華蟾素能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中Bax蛋白表達(dá)，呈現(xiàn)時(shí)-效依賴(lài)關(guān)系（P＜0.05），而對(duì)Bcl-2蛋白表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在正常細(xì)胞生理狀態(tài)下，Bax主要分布在胞質(zhì)，在凋亡刺激因子的作用下，則從細(xì)胞胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到線粒體，并在線粒體外膜形成孔徑較大的通道，導(dǎo)致線粒體膜電位的丟失及線粒體內(nèi)促凋亡分子（如細(xì)胞色素C等）的外流，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程[5]，最終激活caspase-3引起細(xì)胞凋亡[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常的MCF-7細(xì)胞內(nèi)的Bax均勻分布于細(xì)胞質(zhì)中，華蟾素處理后，Bax明顯聚集于線粒體上，呈現(xiàn)明顯的線粒體的轉(zhuǎn)位。表明華蟾素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，伴有Bax蛋白表達(dá)上調(diào)及Bax蛋白線粒體轉(zhuǎn)位。綜上所述，華蟾素在一定劑量范圍內(nèi)抑制MCF-7細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡。其可能的作用機(jī)制在分子水平上，表現(xiàn)為對(duì)凋亡相關(guān)基因Bax的有效調(diào)控，提示華蟾素在乳腺癌中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

[1]Qi FH,Li AY,Zhao L,et al.Cinobufotalin,an aqueous extract from Bufo gargarizans Cantor,induces apoptosis through a mito?chondria-mediated pathway in human hepatocellular carcinoma cells[J].J Ethnopharmacol,2010,3(128):654-661.

[2]Rui D,Xiaoyan C,Taixiang W,et al.Elemene for the treatment of lung cancer[J].Cochrane Database SystRev,2007,17(4): CD006054.

[3]Cory S,Adams JM.Killing cancer cells by flipping the bcl-2/bax switch[J].Cancer Cell,2005,8(1):5-6.

[4]Paradis V,Degos F,Dargere D,et al.Identification of a new mark?er of hepatocellular carcinoma by serum protein profiling of patient swith chronic liver diseases[J].Hepatology,2005,41(1):40-47.

[5]Kukreja RC,Xi L.eNOS phosphorylation:a pivotal molecular switch in vasodilation and cardioprotection[J]?J Mol Ce ll Cardi?ol,2007,42(2):280-282.

[6]Bajt ML,Farhood A,Lemasters JJ,et al.Mitochondrial bax translo?cation accelerates DNA fragmentation and cell necrosis in a mu?rine model of acetaminophen hepatotoxicity[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,324(1):8-14.

[7]Tikhomirov O,Carpenter G.Bax activation and translocation to mi?tochondria mediate EGF-induced programmed cell death[J].J Cell Sci,2005,118(Pt24):5681-5690.

（收稿：2012-06-10 修回：2012-10-28）

（責(zé)任編輯 王 豐）

Relationship between Bax/Bcl-2 and Cinobufotalin Injection-induced Human Breast Cancer Cell Lines MCF-7 apoptosis

XU Xiao-wu,YANG Xiao-min,JIN Zhou-Xiang,et al. The Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou（325027）,China

Objective To explore the changes of Bax/Bcl-2 in Cinobufotalin induced apoptosis in human breast cancer cell line MCF-7. Methods Human breast cancer cell line MCF-7 was exposed to Cinobufotal?in in different concentrations respectively.Each concentration group was exposed for 24 h,48 h and 72 h.MTT assay was performed to detect the proliferation of the cells.The morphological changes of the cells were ob?served with the aid of inverted microscope.Apoptosis index was determined by Terminal deoxynucleotidyl trans?ferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)assay.Western blot analysis was used to test Bax/Bcl-2 expression.Bax distribution was assessed by immunofluorescence staining. Results Cinobufotalin inhibited the proliferation of MCF-7 cells.The percentage of apoptotic cells treated with Cinobufotalin increased as com?pared to untreated cells.Western blotting revealed up-regulation of the Bax protein.However,Cinobufotalin did not affect expression of the Bcl-2 protein.Bax was evenly distributed in cytoplasm in normal MCF-7 cells,In constrast,Bax was translocated from cyto?plasm to mitochondria after Cinobufotalin treatment. Conclusions Cinobufotalin-induced apoptosis in MCF-7 cells was accompanied with an up-expression of Bax protein and a mitochondrial translocation of the protein.

Cinobufotalin injection；human breast cancer cell lines；apoptosis；bax；Bcl-2

Q95-33；R737.9

A

1007-6948(2012)06-0580-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.06.013

1.溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科（溫州 325027）

2.溫州市第三人民醫(yī)院病理科（溫州 325000）

楊小敏，E-mail：yxm19780325@163.com