田 影，尤勝義，李 楠，張朝暉

實(shí)驗(yàn)研究

參芪扶正注射液對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠心肌保護(hù)的作用

田 影1，尤勝義2，李 楠2，張朝暉1

目的：探討參芪扶正注射液對(duì)SAP大鼠心肌保護(hù)的作用及機(jī)制。方法：清潔級(jí)雄性SD大鼠26只隨機(jī)分為3組：K組為假手術(shù)組；M組為僅建立SAP大鼠模型組；S組為造模后予腹腔注射中藥參芪扶正注射液。觀察3組大鼠術(shù)后24 h血清肌酸磷酸肌酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性、線粒體膜電位及心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，并對(duì)心臟及胰腺組織行病理學(xué)檢查。結(jié)果：S組大鼠血清CK-MB、LDH、胰腺及心臟病理評(píng)分和心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均低于M組(P＜0.01)，但高于K組(P＜0.01)，S組Na+-K+-ATPase活性、線粒體膜電位沒有降低的細(xì)胞比例高于M組(P＜0.05)，但低于K組(P＜0.01)。結(jié)論：參芪扶正注射液對(duì)SAP引起的心肌損傷有保護(hù)作用。

參芪扶正注射液；重癥急性胰腺炎；大鼠；心肌保護(hù)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)常并發(fā)多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)，其胰外器官損傷中，心功能障礙(胰心綜合征)較為常見，心血管失代償是導(dǎo)致病死率最高的并發(fā)癥[1]。本研究旨在觀察參芪扶正注射液對(duì)大鼠SAP及其心肌損傷的保護(hù)作用，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型制作 健康清潔級(jí)雄性SD大鼠26只，體質(zhì)量200～250 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。隨機(jī)分為：假手術(shù)組(K組，6只)、SAP模型組(M組，10只)、參芪扶正注射液治療組(S組，10只)。M組和S組均采用5%牛磺膽酸鈉膽胰管內(nèi)逆行注入的方法制作SAP動(dòng)物模型；K組開腹后，翻動(dòng)胰腺數(shù)次后關(guān)腹，不注射?；悄懰徕c。S組按中藥2.5 mL/100g體質(zhì)量，分2次分別于造模后8 h和16 h腹腔注射；K組和M組于相同時(shí)間點(diǎn)給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.2 主要試劑 參芪扶正注射液（麗珠集團(tuán)利民制藥廠，規(guī)格為250 mL，含黨參和黃芪各10 g）；?；悄懰徕c（北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司，用生理鹽水配制成濃度為5%的溶液）；超微量ATPase檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白定量試劑盒（北京蓋寧金諾生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；心肌線粒體提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司）。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 各組大鼠于術(shù)后24 h麻醉活殺，無菌條件下開腹。觀察腹部情況，腹主動(dòng)脈取血。動(dòng)脈血于室溫放置1 h待自然凝固，4℃3000 r/min離心10 min，收集血清。血清標(biāo)本置于-80℃冰箱中保存，以備集中檢測(cè)血清CK-MB、LDH水平。無菌條件下開胸取心臟，將心臟放在一個(gè)置于冰上的培養(yǎng)皿中，分三份：一份用于組織勻漿制備，應(yīng)用分光光度法檢測(cè)Na+-K+-ATPase活性；一份用于分離心肌細(xì)胞線粒體，檢測(cè)線粒體膜電位（用0.5 mL LPBS懸浮線粒體，在線粒體懸液中加入10 μL羅丹明123工作液，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中避光孵育15 min，混勻，設(shè)定激發(fā)波長488 nm、發(fā)射波長525 nm，流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度）。將余部分心臟及部分胰腺，置于4%多聚甲醛中固定，石蠟切片，HE染色。TUNEL法標(biāo)記心肌凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)（Apoptosis Index,AI=心肌細(xì)胞凋亡數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%）。由專業(yè)病理醫(yī)師閱片，行SAP胰腺及心臟病理評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[2-3]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 死亡率統(tǒng)計(jì)采用四格表確切概率法；所有檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠術(shù)后一般情況 K組大鼠術(shù)后一般情況較好。M組大鼠術(shù)后一般狀況較差，出現(xiàn)豎毛、懶動(dòng)、精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、呼吸急促等表現(xiàn)，24 h死亡率為30%。S組一般狀況較M組有改善，24 h死亡率為10%，與M組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 血清指標(biāo) 與K組相比，M組血清CK-MB、LDH含量均明顯增加（P＜0.01）。S組CK-MB、 LDH含量雖然高于K組，但較M組比較明顯降低(P＜0.01)。見表1。

表13組大鼠血清CK-MB和LDH水平(±s)

表13組大鼠血清CK-MB和LDH水平(±s)

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01；與SAP組相比，bP＜0.01

分組假手術(shù)組SAP模型組參芪扶正液組n679 CK-MB(μ/mL) 639.33±37.72 2133.2±111.60a 1332.78±120.39a、b LDH(μ/L) 593.17±45.43 1873.71±141.86a 953.11±74.23a、b

2.3 心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性 M組心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性較K組明顯降低（P＜0.01）；但S組Na+-K+-ATPase活性較高，與M組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 3組大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性(±s，U/mgprot)

表2 3組大鼠心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性(±s，U/mgprot)

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01；與SAP組相比，bP＜0.01

分組假手術(shù)組SAP模型組參芪扶正液組n679 Na+-K+-ATPase活性10.65±0.96 4.62±0.51a8.06±0.73a、b

2.4 心肌線粒體膜電位 M組線粒體膜電位沒有降低的細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照K組（P＜0.01）；S組心肌細(xì)胞線粒體膜電位明顯高于M組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組大鼠線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果±s）

表3 3組大鼠線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01；與SAP組相比，bP＜0.05

組別假手術(shù)組SAP模型組參芪扶正液組n679線粒體膜電位沒有降低細(xì)胞所占百分率（%）95.13±1.94 45.59±2.97a66.61±3.99a、b

2.5 心肌細(xì)胞凋亡指數(shù) 普通光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色，非凋亡細(xì)胞和陰性對(duì)照被蘇木精復(fù)染呈藍(lán)色。K組心肌細(xì)胞出現(xiàn)較少核呈棕黃色的凋亡細(xì)胞；M組則見較多棕黃色核的凋亡細(xì)胞。M組凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯升高（P＜0.01）；與M組相比，S組凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.01）。見表4。

2.6 組織病理學(xué)檢查 光鏡下，M組胰腺間質(zhì)水腫明顯、間質(zhì)出血，可見出血、凝固性壞死和脂肪壞死，壞死區(qū)有大量中性粒細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤，小葉輪廓破壞。S組胰腺病理損害較M組有不同程度的改善。M組心臟肌纖維嚴(yán)重變性、腫脹，大部分肌纖

表4 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s）

表4 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)(±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01；與SAP組相比，bP＜0.01

組別假手術(shù)組SAP模型組參芪扶正液組n679凋亡指數(shù)(%) 1.76±0.54 31.62±4.68a24.06±3.75a、b

維結(jié)構(gòu)消失，有的肌膜已經(jīng)破裂，肌纖維排列紊亂，血管充血，病理結(jié)果符合重癥急性胰腺炎致心肌損傷的表現(xiàn)。S組肌纖維水腫、輕度變性，橫紋模糊。

與K組相比，M組大鼠術(shù)后24 h胰腺和心臟病理評(píng)分明顯升高(P＜0.01)；S組大鼠胰腺及心臟病理評(píng)分均明顯低于M組(P＜0.01)。見表5。

表5 3組大鼠胰腺及心臟病理評(píng)分(±s）

表5 3組大鼠胰腺及心臟病理評(píng)分(±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01；與SAP模型組相比，bP＜0.01

組別假手術(shù)組SAP模型組參芪扶正液組n679胰腺1.67±0.82 12.14±1.35a6.33±1.41a、b心臟0 2.86±0.69a1.67±0.50a、b

3 討論

重癥胰腺炎是病情危篤、并發(fā)癥和死亡率較高的外科急腹癥。最新研究發(fā)現(xiàn)，胰腺的出血壞死除胰酶的組織溶解外，還包括以缺血為特征的胰腺微循環(huán)障礙，且其貫穿于胰腺炎的始終[4]。李欣志等[5]研究發(fā)現(xiàn)，參芪扶正注射液可明顯減輕心肌缺血程度，縮小心肌缺血范圍，顯著增加缺血心臟的冠脈血流量，對(duì)心肌缺血及心肌梗塞引起的血清肌酸激酶活性升高有明顯抑制作用。可減輕大鼠心肌缺血再灌注心肌損傷程度，明顯縮小心肌梗塞面積，降低血清MDA含量，從而對(duì)犬和大鼠實(shí)驗(yàn)性急性心肌缺血具有明顯的對(duì)抗作用。初期休克和胰腺缺血既是SAP的始動(dòng)因子，又是SAP病情惡化的促進(jìn)因素。初期休克不能單純以胰周和腹腔內(nèi)失液解釋，還應(yīng)考慮到血循環(huán)和腹腔液中存在胰酶，血管舒緩素緩激肽、組織胺和其他毒性物質(zhì)，這些可造成全身廣泛血管損傷。而胰腺血管的嚴(yán)重?fù)p傷可引起出血，內(nèi)皮細(xì)胞分離和血栓形成，這些因素可促使和加重胰腺的出血壞死。因此，SAP早期糾正休克及胰腺出血，改善微循環(huán)，阻止病情進(jìn)一步發(fā)展有至關(guān)重要作用。

參芪扶正注射液組方中藥為黨參和黃芪，具有：(1)強(qiáng)心作用。黨參中含有多種氨基酸及多糖，能增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能，提高心排血量而不增加心率，其強(qiáng)心作用與強(qiáng)心苷類似，能改善心功能；黨參含有人參皂苷，可阻滯細(xì)胞膜Ca負(fù)荷，防止Ca超載，減少心肌損傷，促進(jìn)心肌細(xì)胞的修復(fù)[6]。黃芪含黃芪皂甙、黃芪多糖、黃酮類化合物等，通過調(diào)節(jié)Na+-K+-ATPase，使cAMP水解減少，從而增加胞內(nèi)cAMP濃度而使心肌收縮增強(qiáng)振幅明顯擴(kuò)大，對(duì)心肌有正性肌力作用，對(duì)中毒或疲勞衰竭的心臟的作用更為明顯。(2)抗心肌缺血作用，黨參能較好地改善心肌的舒張功能，增強(qiáng)心肌的順應(yīng)性，使冠狀動(dòng)脈灌注阻力減小，有利于左心室心肌的血液供應(yīng)，從而改善心肌缺血。黃芪可提高心肌抗氧化能力、消除自由基、減輕細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化狀態(tài)和維護(hù)細(xì)胞膜的完整性來防護(hù)心肌缺血再灌注損傷[7]。(3)免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體抗病能力。黃芪中的黃芪多糖對(duì)免疫功能有顯著的促進(jìn)作用，能增強(qiáng)特異性和非特異性免疫功能，增加血液中的白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的吞噬功能和殺菌能力，黃芪也增強(qiáng)細(xì)胞免疫[8]。

為進(jìn)一步深入探討參芪扶正注射液保護(hù)重癥急性胰腺炎心肌損傷的機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)通過研究參芪扶正注射液對(duì)血清CK-MB、LDH和心肌Na+-K+-ATPase活性、線粒體膜電位、心肌細(xì)胞凋亡等的影響,為中藥保護(hù)SAP心肌損傷的研究提供更為有力的依據(jù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，參芪扶正注射液可部分抑制SAP大鼠心肌損傷時(shí)血清CK-MB、LDH的溢出，降低血清CK-MB、LDH的活性，初步證實(shí)了參芪扶正注射液可明顯增加SAP大鼠冠脈血流量，促進(jìn)側(cè)支循環(huán)開放和建立，同時(shí)增加心肌的供氧。參芪扶正注射液治療組心肌細(xì)胞Na+-K+-ATPase活性增強(qiáng)，顯示參芪扶正注射液可通過保存細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-ATPase酶活性從而防止內(nèi)鈣超載、維持基質(zhì)體積穩(wěn)定來實(shí)現(xiàn)強(qiáng)心作用，顯著提高左室收縮功能，使心臟搏血量增加。參芪扶正注射液治療組大鼠線粒體膜電位沒有降低的百分比、心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較SAP模型組明顯升高，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示參芪扶正注射液能穩(wěn)定線粒體跨膜電位抑制缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)SAP心肌具有明顯保護(hù)作用。為SAP早期應(yīng)用補(bǔ)氣養(yǎng)血中藥進(jìn)行干預(yù)提供了理論依據(jù)。

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（收稿：2011-12-20 修回：2012-08-22）

（責(zé)任編輯 劉洪斌 屈振亮）

Myocardial Protection of Shenqi Fuzheng Injection in Rats with Severe Acute Pancreatitis

TIAN Ying,

YOU Sheng-yi,LI Nan et al. The Second Affiliated Hospital of Tianjin University of TCM,Tianjin(300150), China.

Objective To investigate the role of Shenqi Fuzheng Injection in rats with(severe acute pancre?atitis SAP)and its possible mechanism of myocardial protection. Methods Twenty Six healthy SD rats were randomly divided into 3 groups:K group was given sham operation;M and S groups were established SAP mod?el in rats;S group was treated by intraperitoneal injection of Shenqi Fuzheng Injection after operation.The levels of serum CK-MB,LDH,Na+-K+-ATPase activity,mitochondrial membrane potential and myocardial apoptosis were measured after 24 h.Pathologic changes of the pancreas and heart were also detected.Results The lev?els of serum CK-MB and LDH,the heart pathological scores and the myocardial apoptosis in S group were lower than those in M group(P＜0.01)but remain higher than those in K group(P＜0.01),while the Na+-K+-ATPase activity and mitochondrial membrane potential were higher than those in M group(P＜0.05)but remained lower than those in control group(P＜0.01). Conclusion Shenqi Fuzheng Injection had myocardial protective ef?fect in rats with SAP.

Shenqi Fuzheng Injection；severe acute pancreatitis；rats；myocardial protection

Q95-33；R657.5+1

A

1007-6948(2012)06-0577-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2012.06.012

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)外科（天津 300150）

2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合外科（天津 300052）

尤勝義，E-mail:shengyiyou@hotmail.com